4種大黃制劑微生物限度檢查方法驗證及分析*

易 偉，李 思，吳晶晶，蘇 華，王曙東

（中國人民解放軍南京軍區(qū)南京總醫(yī)院制劑科，江蘇 南京 210002）

口服制劑中微生物限度的檢查是藥品質(zhì)量控制的一項重要指標。當藥品本身具有抑菌作用時，應(yīng)首先消除抑菌性，以保證檢驗結(jié)果的有效性［1］。本研究中按2015年版《中國藥典（四部）》通則1100生物檢查法（以下簡稱“通則1100”）建立了保腎片、新保腎片、炎黃保腎膠囊和新腎炎膠囊4種大黃制劑相應(yīng)的微生物限度檢查方法，根據(jù)制劑抑菌作用強度的不同，采用了常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法和薄膜過濾法進行驗證，為大黃制劑的微生物限度檢查提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 材料、儀器與試藥

儀器：PYX-DHS-40×50型隔水式電熱恒溫細菌培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）；PYX-DHS.500-BS型隔水式電熱恒溫細菌培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械有限公司）；MJ-Ⅱ型霉菌培養(yǎng)箱（上海恒科有限公司）；SQ510C型立式壓力蒸汽滅菌器（雅馬拓科技貿(mào)易有限公司）；蘇Q／WS2-175-79型電熱恒溫鼓風干燥箱（連云港醫(yī)療器械設(shè)備廠）；MP1100B型電子天平，MP2001型電子天平（上海恒平科學(xué)儀器有限公司）；勻漿儀；開放式過濾器；雙人操作臺。

菌種：金黃色葡萄球菌 ［CMCC（B）26003第 3代］，銅綠假單胞菌 ［CMCC（B）10104第3代］，枯草芽孢桿菌 ［CMCC（B）63501 第 3 代］，大腸埃希菌 ［CMCC（B）44102 第 3 代］，白色念珠菌［CMCC（F）98001 第 3 代］，黑曲霉［CMCC（F）98003第3代］，均購自江蘇省食品藥品檢驗所。

培養(yǎng)基：胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號為151028），胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號為151103），沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號為151022），沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（批號為 151022），麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（批號為1511092），麥康凱液體培養(yǎng)基（批號為 1511092），均由北京三藥科技開發(fā)公司生產(chǎn)，中國食品藥品檢定研究院監(jiān)制，購自江蘇省食品藥品檢驗所。稀釋劑為pH＝7.0的氯化鈉-蛋白胨緩沖液（蛋白胨，規(guī)格為每瓶250 g，北京三藥科技開發(fā)公司，中國食品藥品檢定研究院監(jiān)制，批號為141023，以下簡稱“中性緩沖液”）。依照《中國藥典》微生物限度檢查項下稀釋劑配制方法配制，滅菌備用。

試藥：保腎片（批號分別為 170214，170308，170420），新保腎片（批號分別為 161216，170102，170213），炎黃保腎膠囊（批號分別為 160602，161101，161226），新腎炎膠囊（批號分別為 160510，170703，170908），均由我院制劑科提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備

接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至10 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，將上述各培養(yǎng)基均置細菌培養(yǎng)箱（30～35℃）培養(yǎng)24 h；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至10 mL沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，置霉菌培養(yǎng)箱（20～25℃）培養(yǎng)48h；接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，置霉菌培養(yǎng)箱（20～25℃）培養(yǎng)7 d，使大量孢子形成。用5 mL含0.05%聚山梨酯80的無菌中性緩沖液將孢子洗脫，并過濾孢子至無菌試管內(nèi)。取上述各培養(yǎng)物1 mL，用中性緩沖液10倍遞增稀釋，對常規(guī)法（每皿1 mL）分別制成菌落數(shù)的3 000～10 000 cfu／mL的菌懸液，用培養(yǎng)基稀釋法（每皿0.2 mL）分別制成菌落數(shù)為 15 000～50 000 cfu／mL 的菌懸液。

2.2 供試液制備

保腎片、新保腎片供試液：分別取樣10 g，加中性緩沖液至100 mL，用勻漿儀研勻，制成1∶10的供試液，備用。

炎黃保腎膠囊、新腎炎膠囊供試液：分別取樣5 g，加中性緩沖液至100 mL，置45℃水浴震蕩使溶解，制成1∶20的供試液，備用。

2.3 需氧菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證

2.3.1 常規(guī)法（每皿 1 mL）

菌液組：取2.1項下菌液 0.1 mL，加至 10 mL中性緩沖液中，反復(fù)吹洗，混勻。取1 mL注入平皿中，加入20mL左右對應(yīng)的培養(yǎng)基，每個菌液平行制備2個平皿，測定菌液中的菌落數(shù)。

試驗組：取2.1項下菌液 0.1 mL，加至 10 mL供試液中，反復(fù)吹洗，混勻。取1 mL注入平皿中，加入20 mL左右對應(yīng)的培養(yǎng)基，每個菌液平行制備2個平皿，測定菌落數(shù)。

供試品對照組：取各供試液1 mL注入平皿中，加入培養(yǎng)基，測定供試品的本底菌落數(shù)。

陰性對照組：取中性緩沖液1 mL，分別注入4個平皿中，每種培養(yǎng)基制備2個平皿，作為陰性對照。

2.3.2 培養(yǎng)基稀釋法（每皿 0.2 mL）

方法同常規(guī)法。僅注入平皿液體量減為0.2 mL。

2.3.3 薄膜過濾法

試驗組：取供試液1 mL加至適量的稀釋液中，混勻，過濾，用0.1%蛋白胨沖洗液300 mL分3次沖洗濾膜，在最后1次沖洗液中加入菌落數(shù)不大于100 cfu的試驗菌株，取出濾膜，濾膜菌面朝上貼于瓊脂培養(yǎng)基表面培養(yǎng)，測定菌落數(shù)。

菌液組：取1 mL中性緩沖液代替供試品，按試驗組操作加入試驗菌液進行微生物回收試驗。所用培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件與試驗組一致。

供試品對照組：僅不加試驗菌，其他操作同試驗組。

陰性對照組：取1 mL中性緩沖液代替供試品，不加試驗菌，其他操作同試驗組。

2.4 樣品中大黃酸、大黃素、大黃酚含量測定

各試藥中大黃酸、大黃素、大黃酚含量均采用高效液相色譜（HPLC）法測定。測定方法分別來自王曙東等［2］對保腎片的質(zhì)量標準研究，喬立業(yè)等［3］對新保腎片中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的含量測定，錢文慧等［4］對炎黃保腎膠囊的質(zhì)量控制研究，王曙東等［5］對新腎炎膠囊中蒽醌類化合物的含量測定。

2.5 驗證結(jié)果

依照下列公式計算5種菌的回收率：試驗菌回收率＝［（試驗組平均菌落數(shù)-供試品對照組平均菌落數(shù)）／菌液組平均菌落數(shù)］×100%。結(jié)果見表1至表3。

由表1可見，采用常規(guī)法測定時4藥對金黃色葡萄球菌的回收率均低于50%，且炎黃保腎膠囊和新腎炎膠囊對枯草芽孢桿菌的回收率也低于50%，不符合通則1100的要求（50% ～200%）。故需采用培養(yǎng)基稀釋法對需氧菌檢查計數(shù)方法重新驗證；而用常規(guī)法測定時，4藥對白色念珠菌和黑曲霉的回收率均符合藥典要求。

由表2可見，采用培養(yǎng)基稀釋法對保腎片、新保腎片進行需氧菌、霉菌及酵母菌回收率的測定時，5種菌種的回收率均符合藥典要求。而采用培養(yǎng)基稀釋法時，炎黃保腎膠囊對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收率低于50%，新腎炎膠囊對金黃色葡萄球菌的回收率低于50%，說明抑菌性較強，故考慮用薄膜過濾法進行炎黃保腎膠囊和新腎炎膠囊需氧菌回收率的測定。培養(yǎng)基稀釋法用于炎黃保腎膠囊和新腎炎膠囊霉菌及酵母菌回收率的測定相比常規(guī)法較優(yōu)。

由表3可見，采用薄膜過濾法對炎黃保腎膠囊和新腎炎膠囊進行需氧菌回收率的測定時，5種菌種的回收率均符合藥典要求。

2.6 樣品主成分含量與驗證菌回收率的關(guān)系

對3批次樣品的大黃酸、大黃素、大黃酚含量總和與金黃色葡萄球回收率的相關(guān)性進行了分析，結(jié)果見表4。可見，三者含量總和與金黃色葡萄球菌的回收率呈負相關(guān)。本研究中分別采用常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法、薄膜過濾法進行回收率試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用培養(yǎng)基稀釋法（每皿加入培養(yǎng)基約20 mL）可消除保腎片和新保腎片的抑菌作用，即含量總和的質(zhì)量濃度稀釋至約20 μg／mL時可消除其對金黃色葡萄球菌的抑菌作用；而對于新腎炎膠囊和炎黃保腎膠囊，若采用培養(yǎng)基稀釋法，含量總和的質(zhì)量濃度約60 μg／mL，此時已不能消除其抑菌性，只有通過薄膜過濾法消除其對金黃色葡萄球菌的抑制作用。

表1 常規(guī)法測定4種大黃制劑對各試驗菌株的回收率（%）

表2 培養(yǎng)基稀釋法測定4種大黃制劑對各試驗菌株的回收率（%）

表3 薄膜過濾法測定2種大黃制劑對5個需氧菌菌株的回收率（%）

2.7 控制菌（大腸埃希菌）檢查方法的驗證

2.7.1 常規(guī)法

試驗組：取供試液10 mL（保腎片、新保腎片）或20 mL（炎黃保腎膠囊、新腎炎膠囊）及菌落數(shù)不大于100 cfu的大腸埃希菌懸液1 mL，加入100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，置細菌培養(yǎng)箱（30～35℃）培養(yǎng)18～24 h，取上述培養(yǎng)物1 mL接種至100 mL麥康凱液體培養(yǎng)基中，置細菌培養(yǎng)箱（42～44℃）培養(yǎng)24～48 h。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，置細菌培養(yǎng)箱（30～35℃）培養(yǎng)18～72 h。

陽性對照組：用中性緩沖液代替供試液，按試驗組方法操作加入試驗菌液，所用培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件與試驗組一致。

陰性對照組：用中性緩沖液代替供試液，不加試驗菌，其他操作同試驗組。結(jié)果見表5?？梢?，保腎片、新保腎片和炎黃保腎膠囊的控制菌（大腸埃希菌）能正常檢出，陰性對照未檢出，符合通則1100要求，所以常規(guī)法可用于保腎片、新保腎片和炎黃保腎膠囊控制菌（大腸埃希菌）的檢查。而新腎炎膠囊對大腸埃希菌具有一定的抑菌作用，需作進一步驗證。

2.7.2 培養(yǎng)基稀釋法

試驗組：取供試液20 mL（新腎炎膠囊）及菌落數(shù)不大于100 cfu的大腸埃希菌懸液1 mL，加入200 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，置細菌培養(yǎng)箱（30～35℃）培養(yǎng)18～24 h，取上述培養(yǎng)物1 mL接種至100 mL麥康凱液體培養(yǎng)基中，置細菌培養(yǎng)箱（42～44℃）培養(yǎng)24～48 h。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，置細菌培養(yǎng)箱（30～35℃）培養(yǎng)18～72 h。

表4 樣品中大黃酸、大黃素、大黃酚含量總和與金黃色葡萄球菌回收率的關(guān)系

陽性對照組：用中性緩沖液代替供試液，按試驗組操作加入試驗菌液，所用培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件與試驗組一致。

陰性對照組：用中性緩沖液代替供試液，不加試驗菌，其他操作同試驗組。結(jié)果見表6?？梢?，新腎炎膠囊的控制菌（大腸埃希菌）能正常檢出，陰性對照未檢出，符合通則1100要求，故培養(yǎng)基稀釋法可用于新腎炎膠囊的控制菌（大腸埃希菌）的檢查。

本研究中按通則1100要求，建立了4種大黃制劑的微生物限度檢查法并進行了驗證。保腎片和新保腎片有一定程度的抑菌作用，但可通過稀釋法消除；炎黃保腎膠囊和新腎炎膠囊的抑菌作用強，需采用薄膜過濾法才能消除。結(jié)果見表7。

3 討論

保腎片、新保腎片、炎黃保腎膠囊和新腎炎膠囊均為大黃制劑，大黃為蓼科植物掌葉大黃 RheumpalmatumL.、唐古特大黃 Rheum tanguticum Mzxim.ex Balf.和藥用大黃 Rheum officinale Baill.的干燥根莖［6］，主要功效有瀉下通便、清熱解毒、活血化瘀等［7］。大黃的抗菌作用較強，抗菌譜較廣，對革蘭陽性菌抑制作用較強［8-9］。大黃的有效成分蒽醌類對葡萄球菌、鏈球菌有顯著抗菌活性［10］，同時對幽門螺桿菌［10］、大腸埃希菌［10］、肺炎克雷伯菌［11］、沙眼衣原體［12］等均有抑制作用。

本研究結(jié)果顯示，大黃中大黃酸、大黃素、大黃酚的含量與金黃色葡萄球菌回收率之間呈負相關(guān)，再次驗證了大黃蒽醌類成分的抑菌作用。當大黃酸、大黃素、大黃酚含量總和的質(zhì)量濃度稀釋至20 μg／mL時可用培養(yǎng)基稀釋法消除其對金黃色葡萄球菌的抑制作用；而當質(zhì)量濃度達到60 μg／mL時，培養(yǎng)基稀釋法已不適用，只有通過薄膜過濾法才能消除其對金黃色葡萄球菌的抑制作用。這為其他大黃制劑的微生物限度檢查方法提供了參考。

表5 大腸埃希菌驗證結(jié)果（常規(guī)法）

表6 大腸埃希菌驗證結(jié)果（培養(yǎng)基稀釋法）

表7 4種大黃制劑微生物限度檢查方法

本研究中，炎黃保腎膠囊和新腎炎膠囊為貴重藥品，故取樣量改為5 g，制備成1∶20的供試液。由于這兩種藥品的需氧菌計數(shù)采用薄膜過濾法，按照藥典要求應(yīng)取相當于1 g樣品的供試液（即20 mL）進行薄膜過濾，但因中藥制劑的特殊性，供試液在直接進行薄膜過濾時會堵塞濾膜，過濾很慢，甚至?xí)o法過濾。即使勉強成功，過濾后濾膜上也會鋪滿厚厚的一層中藥殘渣，無法進行菌落計數(shù)，直接影響微生物限度檢驗方法的驗證。故本研究中將取樣量改為相當于0.05 g樣品的供試液（即1 mL）進行試驗，過濾效果較理想，菌落計數(shù)也能順利進行。取樣量減少雖能提高實際操作的可行性，但影響了計量的準確性。對于抑菌作用較強的樣品，2015版《中國藥典》只給出薄膜過濾法。當然也有離心沉淀法［13］或采用無菌濾紙、紗布、脫脂棉進行預(yù)處理［14］等非標準處理方法，這些方法存在準確度、重復(fù)性差，影響因素多，難以標準化等問題。對于具有抗菌活性的中藥固體制劑微生物限度檢查計數(shù)方法的研究，還需進一步探索。