不同能量密度非剝脫點陣激光早期防治兔耳增生性瘢痕的療效觀察

范婭琦 郭碧蓉 曾維惠 劉亞樂

230061合肥，安徽醫科大學第三附屬醫院 合肥市第一人民醫院皮膚科（范婭琦、郭碧蓉）；西安交通大學第二附屬醫院皮膚科（曾維惠、劉亞樂）

增生性瘢痕的發病機制尚不清楚［1］。防治增生性瘢痕的方法主要包括外用硅膠制品、皮損內注射糖皮質激素、壓迫療法、激光治療等［2］。目前臨床使用非剝脫點陣激光治療增生性瘢痕技術已趨于成熟，效果良好且不良反應少［3］。2015年，Shim等［1］使用1 550 nm點陣激光治療早期增生性瘢痕時發現，相同總能量下，高能量低密度的設定能夠更好地防治增生性瘢痕的發生，但其機制尚不明確。基質金屬蛋白酶13（MMP?13）可直接或間接參與膠原形成，調節細胞外基質［4］。本研究通過兔耳瘢痕模型，研究使用不同能量和密度的非剝脫點陣激光，在兔耳增生性瘢痕形成早期進行干預，觀察膠原分布、真皮厚度，觀察MMP?13表達情況，探討最佳的治療參數以及可能的機制。

一、材料和方法

1.實驗動物：健康新西蘭大耳白兔12只，雌雄各半，體重2.5～3.0 kg，月齡3～5個月，單籠飼養，均購自西安交通大學實驗動物中心。（合格證號：SCXK陜2014-003）

2.增生性瘢痕模型構建：兔耳增生性瘢痕模型的構建參考李薈元和蘭海［5］的研究。麻醉兔后，每只兔耳切除5個直徑1 cm區域兔耳全層皮膚，并刮除軟骨膜，形成5個圓形創面，徹底止血，創面暴露。每個創面間隔1 cm以上。為預防感染，連續3 d給予青霉素皮下注射。由2名皮膚科醫師觀察瘢痕組織愈合情況及瘢痕增生、瘢痕形態變化。瘢痕造模約2周后，10只大耳白兔成功形成61處增生性瘢痕，瘢痕組織基本上皮化完成，局部皮膚變白，稍突出皮面，觸之質硬，痂皮已脫落，可進行試驗。余2只大耳白兔作為空白對照組，未行瘢痕組織造模，在同一條件下飼養。造模結束后，將10只大耳白兔隨機分為2組（1周組和3周組），每組5只。另2只1只隨機入1周組取材，另1只入3周組取材。

取材時，分別沿兔耳創面邊緣0.5 cm處環行切開，切取含創面的兔耳組織，每個標本沿直徑切開。正常對照組取直徑1.5 cm的圓形皮膚組織。4%中性甲醛固定，石蠟包埋，制作0.4 mm組織切片，切片烤后-20℃保存，另一半放-80℃冰箱保存備用。

3.實驗參數的選擇及分組：根據文獻［1，3］，預實驗中設定10、30、50、70 mJ 4個能量階梯，設定密度不變，測定MMP?13表達水平。10 mJ與30 mJ組、30 mJ與50 mJ組MMP?13水平差異均有統計學意義（P＜0.05），而50 mJ與70 mJ組差異無統計學意義（P＞0.05），且部分70 mJ組兔耳激光術后紅腫明顯。故本研究設定6組，分別為A組：激光密度100 PPA，能量10 mJ；B組：激光密度100 PPA，能量50 mJ；C組：激光密度169 PPA，能量10 mJ；D組：激光密度169 PPA，能量50 mJ；E組：未行激光處理的瘢痕組織；F組：空白對照組，正常皮膚，未行瘢痕造模處理。各激光組采取相應組別參數激光處理，每次30 s，重復3次，操作間隔1 min。采用Er?glass 1 550 nm非剝脫點陣激光機（韓國Sellas公司），激光處理形狀設定為圓形，直徑1 cm。

4.MMP?13水平測定：1周組30處上皮化組織，按編號隨機分為5組，即A、B、C、D、E組，每組6處。激光處理后1周，處死1周組所有兔子取材，制作蠟塊切片后行免疫組化法測定MMP?13水平。每個切片隨機選取5個視野，采用Image Pro Plus 6.0多媒體圖像處理軟件測定MMP?13抗原表達的平均吸光度。

5.HE、Masson染色：3周組31處上皮化組織，按編號隨機分為5組，即A、B、C、D組各為6處，E組為7處。激光處理后3周，處死3周組所有兔子取材。制作蠟塊切片后行HE、Masson染色，光鏡下觀察真皮層厚度及膠原增生情況；用微尺測出兔耳瘢痕增生塊厚度（自瘢痕表面至軟骨表面）及兔耳瘢痕鄰近腹側正常皮膚厚度（自皮膚表面至軟骨表面）。瘢痕增生指數=（兔耳瘢痕增生塊厚度+兔耳瘢痕鄰近正常皮膚厚度）/兔耳正常皮膚厚度。

6.統計學處理：使用多媒體彩色病理圖文分析系統，各組數據以±s表示。符合正態分布和方差齊性的采用單因素方差分析，符合正態分布但方差不齊的采用Kruskal?Wallis H檢驗，采用SPSS 22軟件進行統計學處理。

二、結果

1.肉眼觀：10只大耳白兔共成功造模形成61處增生性瘢痕。治療前，各組上皮化組織中央均為肉芽組織，較周圍皮膚局部稍隆起，呈淡紅色或深紅色，觸之質硬，稍增厚，表面覆少量痂皮。激光治療后1周時，上皮化組織顏色變淡，厚度降低不明顯。激光治療后3周時，瘢痕組織創面完全上皮化，可見A、B、C、D治療組相較E組（未處理瘢痕組）增生不明顯，增生組織稍軟化。

2.HE染色：F組（正常皮膚組織）表皮組織薄，真皮在各組中最薄，且真皮膠原纖維條帶狀排列，相對較整齊；與F組比較，E組（未處理瘢痕組）真皮層厚度明顯增加，膠原纖維數量增多，致密粗大，排列呈漩渦狀或結節狀；A、B、C、D激光處理各組真皮層厚度增厚，膠原纖維數量增加，但比E組真皮薄，膠原纖維數量減少、排列相對有秩。A、B、C、D激光處理組間真皮層厚度未見明顯差異（圖1）。采用Kruskal?Wallis H檢驗分析，6組瘢痕增生指數差異有統計學意義（H=22.757，P＜ 0.05），兩兩多重比較顯示，B、C、D組顯著低于E組（均P＜0.05）。見表1。

3.Masson染色：F組真皮深層膠原纖維排列規律且厚度相對較薄；E組真皮膠原纖維厚度明顯增厚，排列紊亂，呈結節狀或漩渦狀。A、B、C、D激光處理各組真皮層厚度較E組明顯變薄，膠原纖維排列不規則。而A、B、C、D激光處理各組間真皮層厚度及膠原纖維數量未見明顯差別（圖2）。

表1 6組大耳白兔經不同處理后瘢痕增生指數和MMP?13平均吸光度（±s）

表1 6組大耳白兔經不同處理后瘢痕增生指數和MMP?13平均吸光度（±s）

注：n=6。MMP?13：基質金屬蛋白酶13

圖1 HE染色觀察不同能量密度非剝脫點陣激光處理兔耳增生性瘢痕后的真皮厚度（×100） A組：100 PPA 10 mJ激光組；B組：100 PPA 50 mJ激光組；C組：169 PPA 10 mJ激光組；D組：169 PPA 50 mJ激光組；E組：未行激光處理瘢痕組織；F組：未行任何處理的正常皮膚組織

圖2 Masson染色觀察不同能量密度非剝脫點陣激光處理兔耳增生性瘢痕后的膠原纖維情況（×100） A組：100 PPA 10 mJ激光組；B組：100 PPA 50 mJ激光組；C組：169 PPA 10 mJ激光組；D組：169 PPA 50 mJ激光組；E組：未行激光處理瘢痕組織；F組：未行任何處理的正常皮膚組織

圖3 不同能量密度非剝脫點陣激光處理兔耳增生性瘢痕后MMP?13蛋白表達（免疫組化×400） A組：100 PPA 10 mJ激光組；B組：100 PPA 50 mJ激光組；C組：169 PPA 10 mJ激光組；D組：169 PPA 50 mJ激光組；E組：未行激光處理瘢痕組織；F組：未行任何處理的正常皮膚組織

4.免疫組化檢測MMP?13的表達：MMP?13主要表達于角質形成細胞、成纖維細胞及真皮血管內皮細胞，表皮基底細胞中也有少量表達（圖3）。6組MMP?13平均吸光度見表1。經方差齊性檢驗，各組吸光度符合方差齊性（F=0.678，P=0.643）。單因素方差分析顯示，6組間MMP?13平均吸光度差異有統計學意義（F=3 462.07，P ＜ 0.01）。LSD?t檢驗兩兩多重比較顯示，A、B、C、D組表皮角質形成細胞MMP?13的表達水平顯著高于E組和F組，差異有統計學意義（均P＜0.01）。D組MMP?13彌漫表達于角質形成細胞和成纖維細胞胞質中。同樣密度不同能量組間比較顯示，D組顯著高于C組（P＜0.01），B組顯著高于A組（P＜0.01）。同樣能量不同密度組間比較顯示，A組顯著高于C組（P＜0.01），B組與D組間差異無統計學意義（P=0.02）。E組顯著高于F組（P＜0.05），B組顯著高于C組（P ＜0.01）。

三、討論

增生性瘢痕的治療方法多種多樣，激光療法中，非剝脫點陣激光較為溫和，不損傷表皮屏障，術后誤工期短，且并發癥相對較少。同時衡量效果與風險，非剝脫點陣激光往往被認為是一種較安全的治療方式。已有醫師嘗試使用非剝脫點陣激光在手術后早期對可能產生瘢痕的傷口進行治療，無論是溫哥華瘢痕指數還是雙盲醫師對治療前后照片評分的結果，均顯示治療有效［6］。

非剝脫點陣激光治療瘢痕的機制，可能是通過抑制成纖維細胞活性從而抑制瘢痕形成。在增生性瘢痕形成的早期，成纖維細胞增殖增加且凋亡減少，從而導致膠原纖維產生增多，同時瘢痕中的成纖維細胞MMP表達減少，而MMP抑制劑表達增加［7］。MMP作為降解膠原纖維的主要成分，其表達水平降低，則其降解膠原的作用減弱，從而導致真皮層膠原堆積，最終形成增厚變硬的瘢痕組織。研究顯示［7?8］，MMP表達增加對增生性瘢痕的形成起重要作用，故而測定MMP蛋白的表達水平，可初步定性治療的有效性。本研究中，免疫組化結果顯示，正常表皮角質形成細胞中，MMP?13表達較少，而瘢痕造模后表達增加，激光處理后MMP?13表達顯著增加，說明激光治療可以提高MMP?13的表達，促進膠原降解。

本研究發現，各激光處理組3周后的膠原纖維明顯變薄，各激光處理組瘢痕增生指數均較瘢痕組明顯降低，真皮膠原纖維厚度、膠原纖維排列及瘢痕增生指數在A、B、C、D組間未見明顯差異，延長觀察時長可能可以觀察到對膠原增生的影響。而且，治療次數如果增加，對于膠原增生的抑制效果可能也會隨之增加。

點陣激光的特點之一是存在微治療區，能量和密度是決定治療效果的重要參數［9］。在治療過程中，微治療區以外的組織均未受到損傷，組織細胞可以移行到損傷區域，并進行創傷修復，在此過程中存在膠原重組和血管再生。增加密度，損傷區域增加，創傷加大，對組織的刺激也較大，面臨損傷過度的風險。本研究顯示，在相同密度下，給予較高能量相比于低能量治療，MMP?13水平顯著增加。相同能量下，激光密度的設定對MMP?13表達的影響有待進一步研究，但激光密度的增加可能會加大組織的損傷，不能起到改善治療的作用，而低密度激光的副作用及疼痛感更小。因此，應優先選擇低密度激光。能量的大小決定同一波長下治療的深度，能量越大，達到的深度越深。預實驗中，使用了同一密度下10、30、50、70 mJ不同能量的激光，發現10 mJ組與30 mJ組及30 mJ組與50 mJ組MMP?13表達差異有統計學意義，可認為激光能量增高，MMP?13表達增加，提高激光能量可能促進膠原的降解，從而抑制瘢痕形成。而50 mJ組與70 mJ組MMP?13表達未見明顯差異，說明能量并非越高越好，適當提高能量能夠增加療效。因此，高能量低密度的參數被認為是合適的參數。

本研究顯示，無論采用何種參數的非剝脫點陣激光進行治療，對增生性瘢痕均能起到早期防治作用。同樣能量下，激光密度的變化對MMP?13的表達影響不大，而同樣密度下，高能量激光比低能量激光更能刺激MMP?13表達。結合臨床試驗［1］，高能量低密度被認為是最佳治療參數。

本研究中，使用各個能量密度的非剝脫點陣激光均能有效刺激MMP?13表達增加，且膠原纖維厚度明顯變薄，說明非剝脫點陣激光早期防治增生性瘢痕有效。但由于觀察時長的限制，未能進一步觀察治療后數月的情況。此外，本研究使用兔耳增生性瘢痕組織，其增生期比人瘢痕組織短，激光干預次數也較臨床多，存在著術后紅腫的高風險，因此，臨床應用中使用高能量激光時需慎重。總之，使用非剝脫點陣激光治療增生性瘢痕的最佳治療時機及最佳治療次數仍然要依據增生性瘢痕的發生原因以及患者的期待值而定。