銀屑病皮損CD8αα+T細胞表型鑒定

張洋洋 李冰 王剛

710032西安，第四軍醫大學西京皮膚醫院

銀屑病是以T細胞免疫紊亂為主的慢性炎癥性皮膚病，發病機制尚未闡明。目前普遍認為，CD4+T細胞過度活化是銀屑病免疫學發病機制的中心環節，其中CD4+T細胞活化后產生的白細胞介素17（IL?17）是介導銀屑病發病的關鍵細胞因子［1?2］。近年研究發現，CD8+T細胞也可以分泌IL?17A，且銀屑病患者皮損也有CD8+T細胞浸潤［3?4］。近年研究發現，CD8+T細胞分群更復雜且發揮的功能更豐富。除了細胞毒性T細胞外，CD8+T細胞中還存在發揮負向免疫調控功能的CD8+調節性T細胞（CD8+Treg）和分泌IL?17的Tc17細胞。CD8+Treg細胞參與多種自身免疫性疾病的發病，包括系統性紅斑狼瘡、風濕性關節炎、多發性硬化等［5］。Tc17細胞在銀屑病、風濕性關節病中也發揮重要作用［6］。本研究探究CD8+T細胞在銀屑病中發揮的作用，為CD8+T細胞在銀屑病等炎癥性皮膚病的機制研究奠定基礎。

材料和方法

一、材料

1.皮膚標本：銀屑病皮損標本來自第四軍醫大學西京皮膚醫院2017年1-12月明確診斷的8例進行期斑塊狀銀屑病，男女各4例，年齡24～50歲，銀屑病皮損面積和嚴重程度指數（PASI評分）13.2～22.7，均數為18.3，近3個月未使用系統性藥物，近1周未使用外用藥物及光療。健康對照皮膚取自8例與銀屑病組年齡、皮損取材部位匹配的西京醫院整形外科手術剩余皮膚，男女各4例，年齡23～46歲。本研究通過第四軍醫大學西京醫院醫學倫理委員會批準（KY20172030?1），受試者均簽署知情同意書。

2.主要試劑：兔抗人CD8α單抗、小鼠抗人CD8α單抗、小鼠抗人CD3單抗、小鼠抗人CD56單抗、小鼠抗人CD11c單抗、小鼠抗人Foxp3單抗、小鼠抗人CD25單抗、兔抗人CD122多抗、兔抗人CD103單抗、兔抗人CCR7單抗、Alexa Fluor 488-山羊抗兔、Cy3-山羊抗鼠、Alexa Fluor 488-驢抗羊二抗（美國Abcam公司），小鼠抗人CD8β單抗（美國Santa Cruz Biotechnology公司），小鼠抗人CD45RA單抗（美國Biolegend公司），山羊抗人IL?17A抗體（美國R&D Systems公司）、山羊血清（美國Boster Biological Technology公司）。Hochest為上海碧云天生物技術有限公司產品。

二、方法

1.免疫熒光：取銀屑病皮損、健康對照皮膚組織，4%甲醛固定，石蠟包埋、切片，常規脫蠟至水，高壓修復，于山羊血清中室溫孵育30 min，分別滴加50 μl稀釋后的 CD8α、CD3、CD56、CD11c、CD8β、Foxp3、CD25、CD122、CD103、CCR7、CD45RA、IL?17A一抗混合液（稀釋比例按說明書），4℃過夜。次日室溫復溫1 h，滴加相應的二抗復合物50 μl（1∶200），室溫放置 45 min，洗滌液沖洗，滴加Hochest復合物（1∶1 000），室溫放置10 min，洗滌液反復沖洗，甘油封片。激光共聚焦顯微鏡（日本OLYMPUS公司）于暗室觀察，采集圖像。根據鏡下熒光強度判斷分子表達，低倍鏡及高倍鏡下均未見熒光為陰性，低倍鏡下及高倍鏡下均可見熒光為陽性，低倍鏡下可見弱熒光，高倍鏡下明顯可見熒光為陽性。手動計數表型分子與CD8α共染陽性細胞占CD8α陽性細胞百分比。

2.統計學方法：應用Graphpad Prism7軟件，計量資料用±s表示，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、銀屑病皮損浸潤的CD8+細胞主要是CD8αα+T細胞

銀屑病組皮損浸潤的CD8+細胞表達T細胞標志CD3，不表達樹突細胞標志CD11c和自然殺傷細胞標志CD56。銀屑病組CD8+T細胞中CD8αα+表型占88.48%±7.39%，對照組皮膚局部僅有個別CD8+T細胞浸潤，CD8αα+表型占14.43% ± 13.14%，兩組比較差異有統計學意義（t=11.5，P＜0.01）。見圖1。

二、銀屑病皮損浸潤的CD8αα+T細胞分泌IL?17A

銀屑病皮損中分泌IL?17A的CD8αα+T細胞占24.85%±4.25%，健康對照組皮膚CD8αα+T細胞不分泌IL?17A，差異有統計學意義（t=5.853，P ＜0.01）。見圖2。

圖1 免疫熒光檢測銀屑病皮損與健康人皮膚局部浸潤的CD8+細胞表型（×600） 銀屑病皮損浸潤的CD8+細胞表達T細胞標志CD3，不表達樹突細胞標志CD11c與自然殺傷細胞標志CD56，主要為CD8αα+T細胞

圖2 免疫熒光檢測銀屑病皮損及健康人皮膚局部CD8α與IL-17A共染情況（×600） 銀屑病皮損浸潤的CD8αα+T細胞分泌IL-17A的比例顯著高于健康對照

三、銀屑病皮損浸潤的CD8αα+T細胞表型

銀屑病皮損浸潤的CD8αα+T細胞不表達CCR7和CD45RA，呈CD45RA-CCR7-效應記憶性T細胞表型，表皮浸潤的CD8αα+T細胞98.3%±1.0%表達組織局部定植標志CD103，真皮浸潤的CD8αα+T細胞基本不表達CD103；健康對照皮膚不表達CD103（圖3A）。銀屑病皮損浸潤的CD8αα+T細胞上未見CD8+Treg細胞標志分子Foxp3、CD25和CD122（圖3B）。

圖3 免疫熒光檢測銀屑病皮損浸潤的CD8αα+T細胞的表型（×600） 3A：銀屑病皮損浸潤的CD8αα+T細胞不表達CCR7與CD45RA，表達CD103，表達CD8αα+T細胞浸潤于表皮；3B：銀屑病皮損浸潤的CD8αα+T細胞上未見CD8+Treg細胞標志分子Foxp3、CD25和CD122

討 論

普遍認為，T細胞免疫紊亂是銀屑病發病免疫學機制的中心環節［1］。以往研究發現，銀屑病皮損局部有CD8+T細胞浸潤［4］，Boniface等［7］發現，銀屑病皮損浸潤的CD8+T細胞部分是組織局部定植細胞，但其具體細胞表型尚不明確。CD8+細胞上表達的CD8分子有兩種二聚體亞型，包括α鏈組成的同源二聚體CD8αα和α、β鏈組成的異源二聚體CD8αβ，兩者功能有顯著差別。CD8αβ作為T細胞共受體促進細胞活化，表達于殺傷性CD8+T細胞表面。CD8αα通過識別T細胞受體衍生的肽鏈靶向活化的T細胞發揮負向免疫調控功能［8］，可表達于CD8+T細胞，或非T細胞包括自然殺傷細胞和樹突細胞表面［9］。以往研究發現，在腸道黏膜局部腸上皮淋巴細胞中，CD8αα+T細胞表型占43%［10］，在人皮損單純皰疹復發皮損局部，CD8αα+T細胞主要分布于真表皮交界處［11］，而銀屑病皮損浸潤的CD8+T細胞是否有CD8αα+T表型尚不清楚。

我們發現，銀屑病皮損真、表皮均有CD8+細胞浸潤，通過檢測銀屑病皮損CD8α、CD8β及T細胞標志CD3、樹突細胞標志CD11c和自然殺傷細胞標志CD56，確定了銀屑病皮損浸潤的CD8+細胞，主要是CD8αα+T細胞表型。為了進一步探究銀屑病皮損浸潤的CD8αα+T細胞的表型，我們檢測了鑒別初始細胞分子CD45RA、記憶細胞分子CCR7與組織局部定植細胞標志CD103［12］。免疫熒光示，銀屑病皮損浸潤的CD8αα+T細胞呈CCR7-CD45RA-效應T細胞表型。表皮浸潤的CD8αα+T細胞表達CD103，真皮浸潤的CD8αα+T細胞不表達CD103，提示銀屑病表皮浸潤的CD8αα+T細胞是組織局部定植細胞，真皮處細胞可能來源于外周血。以往研究示，CD8αα+T細胞作為CD8+Treg細胞在小鼠腸道黏膜局部免疫中發揮負向免疫調控作用［10］。我們通過檢測CD8+Treg亞群的標志Foxp3、CD25和CD122［13］，發現銀屑病皮損浸潤的CD8αα+T細胞非CD8+Treg表型，提示CD8αα+T細胞在銀屑病患者皮損發揮的作用可能與小鼠腸道的CD8αα+T細胞不同。

銀屑病發病機制中，IL?17A是關鍵的促炎因子［1?2］。近年來研究發現，IL?17A不僅來源于CD4+T細胞，CD8+T細胞、γδT細胞、中性粒細胞等也可以產生IL?17A，參與銀屑病發生發展［1］。我們發現，銀屑病皮損浸潤的CD8αα+T細胞分泌IL?17A的細胞比例顯著高于對照組，提示銀屑病皮損浸潤的CD8αα+T細胞通過分泌IL?17A參與銀屑病的發生發展。

本研究發現，銀屑病皮損處浸潤的CD8+細胞主要為CD8αα+T細胞，通過分泌IL?17A參與銀屑病的發病，拓展了對CD8αα+T細胞亞群及其功能的認識，明確了CD8+T細胞在銀屑病發病中的作用，豐富了銀屑病的免疫學機制，為CD8+T細胞在炎癥性疾病中的作用研究提供了新思路。