銀屑病患者皮損間充質干細胞環狀RNA表達異常研究

劉瑞風 楊曉紅 梁見楠 張開明

030009太原市中心醫院皮膚科

銀屑病是一種常見的慢性復發性炎癥性皮膚病，嚴重影響患者的身心健康和生活質量。因此，探究其發病原因及尋找有效治療靶點非常重要。研究發現，銀屑病患者皮損間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSC）細胞因子分泌、免疫調節功能及基因表達均有異常［1?4］。環狀RNA分子（circRNA）是近年來發現的一類新的非編碼調控RNA，已證實其參與許多生物學過程和人類疾病［5?6］。我們用RNA測序法檢測銀屑病患者皮損及健康對照皮膚MSC中circRNA表達，并進行詳細的生物信息學分析，從分子水平探討circRNA在銀屑病發病中的作用。

材料和方法

一、對象與材料

1.研究對象：本研究經太原市中心醫院倫理委員會批準（2014010），所有受試對象均簽署知情同意書。銀屑病患者組15例，男8例，女7例；進行期7例，靜止期8例；年齡13～65歲，病程10 d至20年；皮損范圍5%～80%，均為太原市中心醫院皮膚科臨床及病理確診為尋常性銀屑病的門診患者，就診前6個月內局部及全身未使用過糖皮質激素、維A酸類藥物、免疫抑制劑及光療。所有患者均依據銀屑病皮損面積和嚴重程度指數（PASI）評估，PASI分值10.33±3.26（范圍1.8～15.0）。對照組15例，取自我院泌尿外科和整形外科手術切除的正常皮膚，性別、年齡與患者組1∶1匹配（年齡±2歲），經常規體檢無系統性疾病，入選時禁用藥條件同患者組。

2.主要試劑與儀器：DMEM/F12培養基、胎牛血清（美國Hyclone公司），Dispase酶Ⅱ、胰蛋白酶、堿性成纖維細胞生長因子及B27添加劑（美國Sigma公司），circRNA富集試劑盒（上海云序生物科技有限公司），總RNA文庫預處理試劑盒（美國Illumina公司），Trizol、SuperScriptⅢ逆轉錄酶（美國Invitrogen公司），EPICS?XL型流式細胞儀（美國貝克曼庫爾特有限公司）；BioAnalyzer 2100儀器（美國Agilent公司）；ViiA 7實時PCR系統（美國Applied Biosystems公司）。

二、方法

1.皮膚MSC的分離、培養及鑒定：切取銀屑病患者1.5 cm×1 cm皮損，健康對照組取同樣大小的正常皮膚。皮膚MSC的分離、培養及流式鑒定方法同文獻［1?2］。倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況，細胞生長近90%融合狀態時用0.25%胰酶消化傳代。細胞傳至第5代，收獲細胞，分別取2×105個細胞與異硫氰酸熒光素標記的鼠抗人CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105和HLA?DR單克隆抗體室溫避光反應30 min，用PBS洗滌后進行流式細胞儀分析、鑒定。

第5代MSC分別用脂肪、骨及軟骨誘導分化培養基培養。脂肪細胞分化10 d后，用4%甲醛固定，60%異丙醇洗滌，并用油紅O染色。成骨分化3周后，用4%甲醛固定細胞并用2%茜素紅染色。成軟骨分化21 d后，4%多聚甲醛固定，OCT包埋，切成5 μm切片，甲苯胺藍染色。

2.RNA文庫的制備及測序：每組15例標本隨機分為3個亞組，每亞組5個標本，進行circRNA測序。使用每個亞組的總RNA制備circRNA文庫，包括以下步驟：提取總RNA 5 μg，使用circRNA富集試劑盒富集circRNA；使用TruSeq Stranded總RNA文庫預處理試劑盒預處理RNA，構建測序文庫；使用BioAnalyzer 2100儀器進行文庫質控和定量。根據Illumina測序說明，將文庫變性為單鏈DNA分子，在Illumina流動池上捕獲，原位擴增為簇，并在Illumina HiSeq測序儀上進行150循環測序。circRNA測序由上海云序生物科技有限公司完成。

3.測序數據分析：經過Illumina HiSeq測序儀測序，使用CIRI軟件［7］進行circRNA檢測和鑒定，并使用circBase數據庫［8］對所鑒定的circRNA進行注釋，對數據進行標準化，使用t檢驗進行兩組樣品的差異circRNA鑒定，通過倍數變化和P值進行篩選，選擇差異倍數 ≥2，P＜0.05的circRNA作為差異circRNA。對差異circRNA的來源基因進行GO功能分析和KEGG通路分析，并使用microRNA靶基因預測 軟 件 TargetScan 和 miRanda［9?10］進 行 circRNA ?microRNA相互作用預測。

4.對挑選的差異circRNA注釋和功能預測：挑選7個差異較大的circRNA構建circRNA?microRNA相互作用網絡并進行生物信息學分析。

5.實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT?PCR）驗證circRNA及microRNA的表達：對上述網絡中的7個circRNA分子，以GAPDH作為內參，使用ViiA 7實時PCR系統進行qRT?PCR驗證。用Trizol試劑分別提取30例樣本（銀屑病皮損和正常皮膚MSC各15例）總RNA，用SuperScriptⅢ逆轉錄酶合成cDNA。從circBase數據庫得到circRNA序列。引物序列見表1。數據采用2?△△Ct方法分析，以±s表示。

為了驗證circRNA?microRNA相互作用網絡中microRNA的表達，根據與這7個circRNA結合位點的數量，挑選了3個結合位點數量最多的microRNA（hsa?miR?4490，hsa?miR?654?3p和hsa?miR?423?5p）進行qRT?PCR分析。管家基因U6作為內參，基因表達變化采用 2?ΔΔCt計算。ΔCt=Ct目的基因-Ct內參；ΔΔCt= ΔCt患者組- ΔCt對照組。引物序列見表2。

表1 circRNA引物序列

表2 microRNA引物序列

三、統計學方法

分位數歸一化和后續的數據處理使用R軟件包>進行（ttps：//www.r?project.org/）。所有其他統計數據采用GraphPad Prism 5.0軟件分析。患者組和對照組qRT?PCR驗證采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

結 果

一、皮膚MSC的培養和鑒定

流式細胞儀分析結果顯示，患者組和對照組皮膚MSC表面抗原均高表達CD29、CD44、CD73、CD90和CD105，而 CD34、CD45 及HLA?DR表達陰性（圖1）。經成脂、成骨、成軟骨誘導后，皮膚MSC成功分化為相應的細胞和組織（圖2），分離培養的細胞符合MSC的鑒定標準［11］。

二、皮膚MSC的circRNA表達譜

共檢測到6 323個circRNA，其來源基因的染色體位置分別為：外顯子（3 881，61%），內含子（554，9%），正義鏈重疊區（1 035，16%），反義鏈（747，12%），基因間隔（106，2%），見圖 3A。在這些circRNA中，circBase數據庫中包含2 810個；286個以往被研究者報道過，但不包含在circBase數據庫中；3 227個以往沒有被報道過，是首次發現。另外，在6 323個circRNA中，3 499個僅在銀屑病皮損中表達，而1 385個僅在正常皮膚中表達，只有1 439個在兩者中均有表達，見圖3B。

根據變化倍數（≥2.0）和t檢驗結果（P ＜0.05），共鑒定出129個差異表達circRNA。與對照組相比，患者組中123個表達上調，6個表達下調。火山圖（圖3C）和聚類圖（圖3D）顯示出兩組間circRNA表達的差異。CircRNA測序數據已上傳到美國國家生物技術信息中心基因表達數據庫（GSE81106）。

三、circRNA預測和注釋

挑選7個表達差異較大的circRNA，通過microRNA靶基因預測軟件進行差異circRNA?microRNA相互作用預測，它們與microRNA的相互作用網絡見圖4。與這7個差異circRNA關系密切的銀屑病相關microRNA包括，miR?17?5p、miR?30e?5p、miR?142?3p/5p、miR?369?3p、miR?184、miR?4490、miR?654?3p和miR?423?5p等，它們之間存在相互作用。

四、qRT?PCR驗證結果

皮膚MSC來源的7個circRNA均在患者組高表達（圖5A），與RNA測序結果一致。其中，僅chr14：50053483|50329358和 chr5：170610199|170632616在兩組中的表達差異有統計學意義（t=3.182、7.615，P=0.033、0.001）。根據預測的 circRNA?microRNA相互作用網絡，挑選與這7個circRNA結合位點數量最多的3個microRNA，結合位點數量見圖5B。隨后，采用qRT?PCR方法檢測了患者組及對照組各15例標本中3個microRNA的表達，證實這3個microRNA在皮膚MSC中存在，并發現它們在銀屑病皮損中低表達（t=3.993、3.217、2.918，P=0.016、0.032、0.043），見圖5C。

圖4 circRNA注釋與功能預測 7個差異表達的circRNA與microRNA相互作用網絡，黃色圓圈代表circRNA，綠色三角形代表microRNA

討 論

circRNA是區別于傳統線性RNA的一類新型非編碼調控RNA。它們表達豐富，在進化上高度保守，具有組織和/或發育階段特異性［5］，可以與RNA相關的蛋白質結合形成RNA-蛋白復合物，調節轉錄；且富含microRNA結合位點，在細胞中起到microRNA海綿的作用［12］，進而解除microRNA對其靶基因的抑制作用［13?14］，提高靶基因的表達水平，這一作用機制被稱為競爭性內源RNA機制。通過與疾病關聯的microRNA相互作用，circRNA在疾病中發揮著重要的調控作用。

圖5 qRT?PCR驗證circRNA及microRNA 5A：7個差異表達的circRNA測序及PCR驗證圖；5B：每個circRNA上microRNA結合位點的數量；5C：circRNA?microRNA互作網絡中挑選的3個microRNA的PCR驗證結果，a：P＜0.05。每組均為15份標本

我們發現，銀屑病患者皮損MSC circRNA表達異常，并報告了3 227個新的circRNA。我們共檢測到6 323個circRNA，其中大部分來自外顯子（61%），與以往報告的結果一致［12］。患者組與對照組相比，有129個circRNA呈差異表達。為了揭示這些circRNA的作用，在這些差異表達的circRNA中挑選了7個差異倍數較大的circRNA構建了circRNA?microRNA相互作用網絡（圖4）。此網絡圖表明，這些circRNA與以下microRNA關系密切，包括miR?17?5p、miR?30e?5p、miR?142?3p/5p、miR?369?3p、miR?184、miR?4490、miR?654?3p和miR?423?5p。值得一提的是，已有文獻報道miR?17?5p、miR?30e?5p和miR?142?3p/5p在銀屑病皮損中差異表達，且miR?142?3p明確參與表皮的炎癥［15］；銀屑病患者血清和皮損中的miR?369?3p表達均升高，在皮損中的水平與疾病嚴重程度呈正相關［16］。此外，miR?184在銀屑病皮損中表達上調，并直接影響其他microRNA的表達，可能在角質形成細胞相關疾病中發揮獨特的作用［17］。以上結果均提示，circRNA可能通過吸附這些與銀屑病相關的microRNA從而解除其對靶基因的抑制作用，使靶基因表達升高，進一步參與銀屑病的發病。為了證實這些microRNA的真實存在，我們挑選其中3個采用qRT?PCR進行驗證，結果表明，它們不但在皮膚中存在，而且在銀屑病患者皮損表達異常（圖5C）。

本研究結果證實，銀屑病皮損MSC的circRNA表達異常。通過詳細的生物信息學分析，我們認為circRNA參與了銀屑病的發病。本研究結果及進一步的分子機制深入探討將為銀屑病發病機理研究及尋找新的治療靶點提供新思路。本課題只研究了皮膚MSC的circRNA表達，沒有研究這些寡核苷酸在角質形成細胞及免疫細胞中的表達，并且沒有進入深入的機理分析。我們目前正在進行更廣泛和深入的研究，來闡明circRNA在銀屑病發病中的作用。