國內外HER-2/neu基因擴增型胃癌臨床病理及預后特征分析

黃秀芳 原向偉 劉瓊茹 梁津杰 方曉華 蔡育波 楊文麗 黃 輝 陳艷虹 陳仙蘭張 鑫,3 林碧華

1.廣東省江門市中心醫(yī)院病理科，廣東江門 529030；2.廣東省江門市中心醫(yī)院脊柱骨科，廣東江門 529030；3.廣東醫(yī)科大學廣東省醫(yī)學分子診斷重點實驗室，廣東東莞 523808；4.廣東醫(yī)科大學生物化學與分子生物學教研室，廣東東莞 523808

胃癌（gastric carcinoma）是常見的消化道惡性腫瘤，其中胃腺癌最為常見，可占85%以上[1-2]。世界新發(fā)胃癌的患者，一半以上位于我國[3]，由于早期癥狀不典型，普查不及時，我國早期胃癌的診斷率不足10%，5年生存率較低[4-5]，可見我國胃癌防治的嚴峻，深入研究胃癌的發(fā)生機制，尋找更為有效的診斷標記物及潛在的治療靶點意義重大。曲妥珠單抗（Trastuzumab）在人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2， HER-2）陽性胃癌分子靶向治療過程中的療效已明確，熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization， FISH）技術是檢測HER-2/neu擴增的金標準，也是重要的胃癌伴隨診斷項目[6]。雖然HER-2/neu擴增可指導患者用藥，但HER-2/neu擴增的胃癌患者中，其臨床病理特征及預后仍有爭論。本文利用癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）的數據和我院胃癌患者數據進行比較，探索HER-2/neu擴增與胃癌臨床病理特征及預后的相關性。

1 資料與方法

1.1 TCGA胃腺癌數據下載

參考文獻[7-8]，在R語言軟件平臺（v3.2）上通過TCGAbiolinks程序的GDCquery函數下載癌癥基因組圖譜中胃腺癌的基因組拷貝數信息（由Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0芯片過濾得到）及對應樣品的臨床信息；利用GDCprepare_clinic函數輸出整理各患者的病理臨床信息。數據庫的更新下載日期為2018年5月31日，基礎信息較為完整的有效患者數為441例。

1.2 全基因組拷貝數變異分析

參考文獻[9-11]，在GenePattern公共服務器平臺（https：//genepattern.broadinstitute.org/），利用 GISTIC 2.0軟件分析各組腫瘤樣品的全基因組拷貝信息，參考基因組為人類19版基因組（human genome 19，hg19），探針標記的物理位點信息（Markers file）和CNV參照信息（CNV file）均整理自SNP Array 6.0的第 35版本信息（http：//www.affymetrix.com/）；關鍵的運行參數均為默認，并分析HER-2/neu基因（ERBB2）的拷貝數變異情況。

1.3 臨床資料

選擇2008年1月～2014年12月，在我院進行手術切除的胃癌標本404例，術前或活檢前均未接受放、化療及免疫治療，所有標本均經病理學明確診斷為胃腺癌。三組數據集的一般臨床病理信息比較見表1。

1.4 FISH法檢測HER-2/neu基因擴增水平

HER-2/neu基因檢測試劑盒購自廣州達安基因股份有限公司（國械注冊20153402099），操作步驟及判讀標準參考說明書。根據病理醫(yī)師選定的檢測區(qū)域在蠟塊上做標記，按4.0μm石蠟切片，65℃烤片1h；二甲苯室溫脫蠟，逐級酒精水化，超純水浸泡3min，沸水煮片20min；蛋白酶K反應液覆蓋組織，37℃消化5min，過2×SSC緩沖液，逐級酒精脫水；探針雜交液覆蓋組織，加蓋蓋玻片，橡皮膠水封邊，85℃變性5min，37℃避光雜交過夜；孵育結束后，過2×SSC緩沖液，過0.1% NP-40/2×SSC緩沖液，70%乙醇脫水3min，滴加DAPI染液，加蓋蓋玻片，熒光顯微鏡觀察計數，并參考文獻[12]進行判讀。

1.5 統(tǒng)計學方法

計數資料用頻數表示，用Excel 2010及GraphPad Prism 5.0軟件處理數據，各組間頻數數據（2×2頻數表）統(tǒng)計使用χ2檢驗（Chi-squared test）或Fisher’s精確檢驗（Fisher’sexact test），生存分析使用Kaplan-Meier分析、Log-rank檢驗，檢驗水平α=0.05。

2 結果

2.1 一般臨床病理信息比較

比較TCGA數據庫與我院患者一般臨床病理信息，可知兩群患者在年齡（χ2=30.082，P＜ 0.001）、T分期（χ2=46.662，P＜0.001）和N分期（χ2=27.073，P＜0.001）的分布中有差異，在性別、病理分級、M分期及臨床分期中的分布無差異。

2.2 HER-2/neu基因擴增情況

TCGA數據庫中，HER-2/neu基因擴增65例，占全部患者的14.7%；我院HER-2基因擴增69例，占全部患者的17.1%，兩組數據分布無統(tǒng)計學差異（χ2=0.865，P=0.352）。

2.3 HER-2/neu基因擴增與胃癌臨床病理學特征間關系

TCGA數據庫和我院樣品中，男性HER-2/neu擴增率高于女性，差異均具顯著性（χ2=5.165，P=0.023及χ2=4.127，P=0.042）；低、中病理分級的 HER-2/neu

擴增情況明顯高于高病理級別，差異均具顯著性（χ2=11.314，P＜0.001及χ2=7.121，P=0.008）。此外，不同年齡、T分期、N分期、M分期及臨床分期的胃癌HER2陽性率均無統(tǒng)計學差異，見表2。在性別、年齡、病理分期及TNM分期中，HER-2/neu擴增分布在TCGA數據庫與我院樣品間差異無統(tǒng)計學意義。

表1 TCGA及江門市中心醫(yī)院胃癌患者的基本信息

表2 TCGA及江門市中心醫(yī)院胃癌患者的基本信息

2.4 HER-2/neu基因擴增與胃癌患者預后間關系

TCGA數據庫和我院胃癌患者生存曲線的對比，見圖1，其中HER-2/neu擴增患者的中位生存時間是26.4個月和38.8個月，HER-2/neu非擴增患者的中位生存時間是29.4個月和39.1個月，兩群患者的生存預后差異無顯著性（P=0.170和P=0.602）。

圖1 TCGA胃癌患者生存預后情況

3 討論

HER-2/neu的編碼基因（又稱 ERBB2），位于人染色體17q21，編碼185kD的I型跨膜酪氨酸激酶，其基因擴增存在于乳腺癌、胃癌、卵巢癌、子宮內膜癌、結直腸癌和肺癌等惡性腫瘤[13-14]。HER-2/neu在胃癌及胃食管結合部癌的陽性率為4.4%～53.4%，均值為17.9%[15]； TCGA數據庫中，HER-2/neu的陽性率為14.7%，我院樣品HER-2/neu的陽性率為17.1%，兩組數據差異無顯著性，均符合文獻報道[15-16]，表明國內外胃癌中HER-2/neu的擴增情況較為一致。

HER-2/neu的擴增和過表達，可通過磷脂酰肌醇 3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K）/蛋 白 激 酶 B（protein kinase B， PKB，又 稱 Akt）及絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases， MAPK）途徑影響腫瘤細胞的增殖、凋亡、粘附、分化及浸潤等[17]。乳腺癌中HER-2/neu的擴增明確與差的病理臨床特征相關[13]，但在胃癌未見統(tǒng)一的結果。本研究顯示，在TCGA數據庫和我院樣品中，HER-2/neu的擴增與患者的年齡、T、N、M分期及臨床分期均不相關，但男性患者HER-2/neu擴增率高于女性；低病理級別胃癌HER-2/neu擴增率顯著高于高級別的胃癌，表明HER-2/neu擴增與男性及胃癌高分化程度相關，符合文獻報道[18]，提示男性、分化較好的胃癌是曲妥珠單抗治療的主要人群。

HER-2/neu擴增是胃癌重要的預后因素，HER-2/neu擴增患者的5年生存率較非擴增低，是胃癌患者預后的獨立檢測指標[19]；也有文獻報道[20]，HER-2/neu的擴增與患者總生存時間及無復發(fā)生存時間均無關系。我們發(fā)現(xiàn)HER-2/neu的擴增情況不能區(qū)分患者的總生存時間，表明在綜合臨床分期、病理分級和靶向HER-2藥物使用情況下，HER-2/neu的擴增不能作為判斷患者預后的關鍵因素。是否在特定臨床分期、病理分級及治療手段下，HER-2/neu的擴增能作為胃癌患者預后判斷指標，這需要我們進一步的研究。