骨質疏松癥中醫類型之間的本質區別及生物學特征

張葆鑫，郝廷，楊曉龍，王興國

（內蒙古醫科大學第二附屬醫院，內蒙古呼和浩特 010000）

據相關研究顯示，疾病的發生多與外界因素和基因因素相關，而線粒體DNA（mtDNA）容易受到自由基的攻擊，并導致mtDNA突變，從而形成惡性循環，導致生理機能的衰退[1]。該次實驗選取2016年1—12月于該院就診的骨質疏松癥患者共150例，并根據中醫辨證類型進行分組，著重了解骨質疏松癥與中醫證型之間的關聯，討論其相關性，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

實驗選取于該院就診的骨質疏松癥患者共150例，并根據中醫辨證類型進行分組，具體而言可分為肝腎陰虛證、脾腎陽虛證和氣滯血瘀證，每組50例。與此同時，選擇了50名非骨質疏松癥的健康人群（氣血平和證）作為對照組進行分析。患者年齡在50～63歲之間，且排除了患有繼發性骨質疏松的情況，所有患者均為自愿參與實驗，在年齡、病程等一般資料對比差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 檢測方法

首先，需要對所有患者進行血液標本采集，即在入院后的第二天進行空腹抽血，且抽血前一天晚上10點后禁食，抽血量為8 mL，共2管。其中，一管為干燥管，另一管為含有肝素鈉的抗凝管。干燥管樣本需要在2 h內進行3 000 r/min離心20 min；肝素管需要搖勻，均放置于-70℃的低溫箱中等待檢測。在檢測方面，需要對mtDNA拷貝數進行相關檢測，并根據酶聯免疫法對8－羥基脫氧鳥苷酸濃度進行分析，其試劑盒批準號：201301。除此之外，我們將采用PCR對mtDNA的ND3基因和18S基因進行擴增曲線的測量，并計算閾值，其表達式為ΔΔCt=實驗組基因 ΔCt－對照組基因 ΔCt[2]。

1.3 觀察指標

在實驗中將對患者mtDNA拷貝數及8－羥基脫氧鳥苷酸（8－OHdG）的含量進行測定，并對比分析骨密度與mtDNA拷貝數及8－OHdG的相關性。8－OHdG濃度的檢測需要采用雙抗體夾心法，在HRP酶的作用下，可轉變為藍色，而在酸的作用下可轉換為黃色。其顏色可說明8－OHdG濃度的相關性，并計算具體值。除此之外，在mtDNA拷貝數的檢測方面將通過ABI 3 900臺式高通量DNA合成儀完成具體操作，并結合人線粒體NADH脫氫酶亞單位2以及18sRNA的基因序列進行分析。

1.4 診斷標準

在診斷上，我們將參照骨質疏松癥的國際診斷標準，并測量骨密度 （BMD），即t值超過-1.0標準差（SD）則視為正常，t值介于-1.0SD和-2.5SD之間，則為骨量減少；當t值小于-2.5SD時則為骨質疏松癥，當患者t值小于-2.5SD并合并骨折癥狀，則判定為嚴重的骨質疏松癥組。

1.5 統計方法

對上述兩組患者各項記錄數據進行分類和匯總處理，采取SPSS 19.0統計學軟件對上述匯總數據進行分析和處理，計數資料采取百分率表示，計量資料采取均值±標準差（±s）表示，在連續變量的對比上采用 Pearson相關分析法；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

在mtDNA拷貝數結果上，肝腎陰虛組、脾腎陽虛組均低于氣血平和組，但是，氣滯血瘀組則表現出最高值，與其他兩組患者治療效果相比差異有統計學意義（P＜0.05）。 與此同時，在 8－OHdG 的濃度對比上，骨質疏松癥組各個中醫證型的患者其數值均低于氣血平和組，且脾腎陽虛組數值最高，肝腎陰虛組和氣滯血瘀組則無明顯差異，具體情況如表1所示。

在相關性分析上，mtDNA拷貝數與骨密度呈正相關，而8－OHdG與骨密度則呈負相關性，具體而言，在肝腎陰虛組中，相關系數為0.854，mt DNA拷貝數與骨密度為正相關性，而8－OHdG與骨密度相關系數為-0.862，則為負相關性，其他組別詳情見表2。

表1 各組間的mtDNA拷貝數比較情況（±s）

表1 各組間的mtDNA拷貝數比較情況（±s）

組別n2－ΔΔCt ρ8－OHd G/（ng·L-1）ρA，BMD/（g·cm-2）肝腎陰虛組（n=50）脾腎陽虛組（n=50）氣滯血瘀組（n=50）氣血平和組（n=50）0.851±0.454 0.844±0.846 1.451±0.748 1.208±1.228 196.54±40.32 218.36±47.33 198.35±38.25 178.63±84.69 0.635±0.014 0.702±0.055 0.701±0.048 1.365±0.124

3 討論

在中醫理論中，骨質疏松癥屬于“骨痿”的范疇，其最為主要的發病機制則是腎虛，并以血瘀作為病理基礎，兩者相互依存，共同作用引起質變。在找準“腎虛血瘀”的病理機制后，我們對中醫證型進行了分別的討論實驗。據相關學者指出，原發性骨質疏松癥的病機主要是多瘀和多虛，因此得出了相應的四大類臨床證型，分別為：腎陽虛衰、肝腎陰虛、脾腎陽虛、氣滯血瘀，結合現代醫學手段，進一步發現中醫證型間的差異性，尋找實質具有重要意義。

該次實驗研究的線粒體基因技術則為中醫證型的研究提供了新的方向，這也是對外界環境和基因共同作用的一次理論上的突破，是在內外因素的共同干擾下得出新的結論。線粒體是體細胞的呼吸中心，而mtDNA作為唯一的核外遺傳物質，其自身具有結構上的特殊性，屬于細胞內核外遺傳物質。因此，容易出現損傷并導致突變現象。引起與mtDNA相關因子出現損傷的因素較為多樣、復雜，其中，最常見的則為氧化應激，直接會引起蛋白質、DNA的氧化性損傷[4]，并加重患者病情，最終導致急性、慢性損傷。

8－OHdG則屬于活性氧族，是導致DNA氧化損傷的產物之一，也是DNA突變的標志。當患者出現缺血、缺氧問題，8－OHdG含量將出現一定程度的上升。而8－OHdG的產生主要依賴于患者體內的活性氧，當活性氧不斷增加時，氧化應激過程所產生的ROS將會直接攻擊mtDNA，并生成8－OHdG。此時，由于mtDNA自我修復能力較差，且缺乏組蛋白的保護，因此容易導致退行性疾病。在該次實驗研究中，骨質疏松癥中醫證型的三組患者的8－OHdG水平均高于健康組人群，進一步證明了骨質疏松癥對患者造成的氧化損傷，且以脾腎陽虛癥患者最為突出。相對地，在骨密度的相關性研究結果中，脾腎陽虛證型的患者與8－OHdG的關聯最大。

從其他方面來看，線粒體NADH脫氫酶亞單位2基因能夠直接參與到呼吸鏈中，并參加了氫與電子之間的傳遞，可介入氧化磷酸化而生成ATP。在進一步檢測ND2基因的過程中，可以更為準確、直觀地反映mtDNA拷貝數。該基因已經成為分析mtDNA損傷線粒體功能障礙的重要指標。據其他研究顯示，ND2基因突變與多種疾病相關，包括常見的高血壓、糖尿病等，其中最為肯定的疾病為帕金森和阿爾茨海默病。當mtDNA缺失數達到一定的臨界值時，則會導致細胞功能障礙，減退，該因素也成為判定衰老的分子生物學標志之一[5]。

綜上所述，線粒體DNA相關因子與骨質疏松癥中醫證型存在一定的相關性，其中脾腎陽虛組與8－OHdG的相關性最高，肝腎陰虛組則與mtDNA拷貝數相關性最高。