白藜蘆醇對痛風患者外周血單個核細胞Sirtuin 1表達的影響

楊其彬，何泳龍，鐘曉武，青玉鳳，謝文光，周京國

(1.川北醫學院附屬醫院風濕免疫科；2.川北醫學院附屬醫院風濕免疫研究所，四川 南充 637000；3.成都醫學院第一附屬醫院風濕免疫科，四川 成都 610000)

痛風作為尿酸代謝異常所致的疾病，通過大鼠動物實驗及臨床試驗研究發現，白藜蘆醇有降尿酸活性，其機制可能通過競爭性抑制黃嘌呤氧化酶活性而實現的[1]，但其具體作用機制尚不完全清楚。除此之外，白藜蘆醇在膠原誘導大鼠關節炎及兔實驗性骨關節炎動物模型中表現出良好的抗炎效果[2-3]。研究表明，痛風性關節炎發病過程中大量的促炎癥因子如白介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-6等明顯增高[4]。王鵬等[5-6]在尿酸鹽晶體誘導的大鼠急性痛風性關節炎動物模型中已證實白藜蘆醇能夠明顯的降低關節液中IL-1β、趨化因子CCR5水平及滑膜核因子(NF)-κB p65蛋白表達，實驗結果表明，白藜蘆醇可以減輕急性痛風性關節炎的炎癥程度，但其抗炎機制需進一步深入研究。

Sirtuin (SIRT) 蛋白家族是哺乳動物與沉默信息調節因子2(silent information regulator 2，Sir2)同源的一個進化保守的蛋白質家族，在人類分別命名為SIRT1～7[7]。白藜蘆醇作為SIRT1天然激動劑，Howitz等[8]在2003年最先證實了白藜蘆醇是通過激活細胞內SIRT1的活性，調控下游基因轉錄。在炎癥反應中，NF-κB的p65亞單位是SIRT1的直接靶點，SIRT1通過去乙?；饔媒档蚇F-κB p65的乙?；綇亩种破鋵τ谙掠我蜃拥霓D錄功能[9]。Takada等[10]將白藜蘆醇與不同非甾體抗炎藥物進行比較發現白藜蘆醇具有很強的抗炎活性，SIRT1可以明顯減少活性氧(ROS)的產生以減弱炎癥反應。由此可見，SIRT1在調控炎癥反應過程中可能發揮重要作用。

朱小霞等[11]進行SIRT1在常見風濕性疾病中的研究進展綜述表明，骨關節炎、骨質疏松、類風濕關節炎等病中SIRT1表達明顯降低，而提高SIRT1活性能明顯緩解病情；也有少數研究者存在不同觀點，活動性狼瘡患者血CD4+T細胞及類風濕關節炎患者滑膜細胞中的SIRT1表達水平明顯升高。SIRT1的生物學功能作用多樣，而白藜蘆醇是否活化SIRT1調控痛風患者炎癥反應目前尚未見報道。因此，本文從免疫炎癥的角度以人外周血單個核細胞(PBMCs)為研究樣本，檢測了痛風患者不同期的SIRT1基因及蛋白表達水平，體外不同濃度白藜蘆醇干預尿酸鹽晶體(MSU)刺激間歇期痛風患者誘導急性炎癥反應的SIRT1、IL-1β蛋白及NF-κB p65 mRNA水平的變化，探討白藜蘆醇參與痛風炎癥調控機理及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 臨床資料 選擇川北醫學院附屬醫院2014年1月至2014年11月收治的痛風急性期(AG)患者48例，均符合1977年美國風濕病協會(ACR)發布的診斷標準；痛風間歇期(IG)患者40例，均為AG后至少2周、血沉和CRP正常者，排除痛風石形成、尿酸鹽腎病及尿酸性尿路結石患者?；颊呔鶠槟行裕珹G組年齡17～74歲，平均(49±12)歲，病程(7±5)年；IG組年齡24～67歲，平均(44±12)歲，病程(11±6)年。對照組為80例男性健康體檢者，年齡23～65歲，平均(46±11)歲，均無痛風家族史、心腦血管病史、感染等炎癥疾病，實驗室指標無異常。3組性別、年齡具有可比性。

1.1.2 主要試劑與儀器 人淋巴細胞分離液(天津灝洋生物公司)，Trizol試劑(Invitrogen公司)，RNA逆轉錄試劑盒(日本TaKaRa公司)，熒光染料試劑盒(ABI公司，USA)，兔抗人SIRT1(CST)，兔抗人GAPDH(北京康為世紀)，二抗為山羊抗兔IgG(中杉金橋)，低溫高速離心機5417R(美國Eppendorf公司)，7900 Real-Time PCR儀(美國ABI公司)，白藜蘆醇(美國sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 白藜蘆醇配制 濃度為99%白藜蘆醇粉末用二甲基亞砜(DMSO)充分溶解，配成200 μmol/L儲存液，正壓過濾除菌分裝，-20℃保存，使用濃度根據不同的實驗目的配制不同的濃度。

1.2.2 細胞培養及刺激 不同濃度白藜蘆醇干預MSU刺激6例間歇期痛風患者外周靜脈血，根據白藜蘆醇不同濃度(0、100、200、400 μmol/L)及空白對照分為五組，100 μg/mL MSU聯合白藜蘆醇(0、100、200、400 μmol/L)于37 ℃細胞培養箱孵育6 h后分離血漿及PBMCs，血漿分裝后在-80 ℃凍存備用，收集的PBMCs用于提取RNA及制備細胞蛋白。

1.2.3 mRNA檢測 采用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)方法。SIRT1、NF-κB p65及內參β-actin基因引物由上海生工生物工程有限公司合成，SIRT1上游：5’-GGTATTTATGCTCGCCTTGC-3’，下游：5’-CCTGTTCCAGCGTGTCTAT-3’，產物長度115bp；NF-κB p65上游：5’-GTGGGGACTACGACCTGAAT-3’，下游：5’-GGGGCACGATTGTCAAAGAT-3’；β-actin上游：5’-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3’，下游：5’-GTAGTTTCGTGGATGCCACAG-3’，產物長度128 bp。取肝素鈉抗凝外周靜脈血3 mL，人淋巴細胞分離液(Ficoll)分離PBMCs，Trizol試劑提取總RNA并逆轉錄合成cDNA，RT-qPCR為25 μL反應體系：12.5 μL Power SYBR Green PCR Master Mix，各1 μL 10 pmol/L引物，2 μL cDNA，8.5 μL雙蒸水。反應條件為：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個循環。每份標本均設復孔。所有擴增均在ABI 7900 Real-Time PCR儀上進行，反應結束后作溶解曲線。以目的基因的Ct值減去內參的Ct值為△Ct，2-△Ct值表示目的基因mRNA表達水平。所有標本均重復檢測2次取均值。

1.2.4 蛋白檢測 采用Western blot方法。分別提取AG、IG及HC組PBMCs總蛋白各6例，并進行BCA蛋白濃度定量，取等量蛋白上樣量，十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，轉膜，封閉，一抗4 ℃孵育過夜(SIRT1、IL-1β、GAPDH稀釋度均為1∶1 000)，二抗室溫孵育1 h(二抗稀釋度1∶3 000)，TBST洗膜后ECL化學發光試劑盒顯色，使用Fusion Fx5曝光成像，Image J軟件對顯影條帶灰度值進行分析，以GAPDH作為內參，SIRT1/GAPDH、IL-1β/GAPDH灰度值作為目的蛋白表達量。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 痛風患者外周血單個核細胞SIRT1 mRNA和蛋白表達變化特點

本研究分別使用熒光定量PCR和Western blot法檢測痛風患者SIRT1 mRNA和蛋白表達水平，熒光定量PCR檢測所有標本均重復2次并取均值， AG、IG和HC 3組SIRT1 mRNA表達水平比較有統計學意義(F=4.89，P<0.05)；組間比較發現，SIRT1 mRNA在AG、IG患者的表達水平顯著低于HC(t=2.76，2.47；P分別<0.01，0.05)，而AG與IG比較顯示，AG患者SIRT1 mRNA更低，但無統計學意義 (圖1A)。Western blot檢測痛風患者AG、IG和HC 3組SIRT1蛋白表達水平有統計學意義(F=45.01，P<0.001)，組間比較發現AG、IG組SIRT1蛋白水平顯著低于HC組(t=9.40，3.53；P分別<0.01，0.05)，AG組SIRT1表達水平顯著低于IG組(t=5.87，P<0.01)(圖1B)。

2.2 白藜蘆醇促進尿酸鹽晶體刺激痛風患者外周血單個核細胞SIRT1 mRNA和蛋白表達

為明確白藜蘆醇對SIRT1功能的改變特點，本文檢測了不同濃度白藜蘆醇干預MSU刺激間歇期痛風患者外周血單個核細胞SIRT1 mRNA和蛋白水平。SIRT1 mRNA在各組間存在有顯著差異(F=2.91，P<0.05)，MSU聯合200 μmol/L和400 μmol/L濃度白藜蘆醇組較MSU組、空白對照顯著升高(P<0.01)，其余各組無顯著差異(圖2A)；MSU刺激組的SIRT1蛋白水平較空白對照顯著降低(t=7.51，P<0.01)，200 μmol/L和400 μmol/L的白藜蘆醇聯合MSU組較MSU組顯著升高(t=5.48，10.27；P均<0.01)，而100 μmol/L白藜蘆醇聯合MSU組SIRT1較MSU組有所升高，但無統計學意義(圖2B)。

2.3 白藜蘆醇降低尿酸鹽晶體刺激痛風患者外周血單個核細胞IL-1β蛋白水平

IL-1β作為痛風炎癥反應中關鍵促炎因子，我們檢測了不同濃度白藜蘆醇干預MSU刺激間歇期痛風患者外周血單個核細胞中IL-1β蛋白水平。IL-1β蛋白水平在各組間存在有顯著差異(F=136.6，P<0.001)，進一步比較發現MSU刺激組的IL-1β蛋白水平較空白對照顯著升高(t=20.8，P<0.01)，200 μmol/L和400 μmol/L白藜蘆醇聯合MSU組較MSU組顯著降低(t=9.96，7.81；P均<0.01)，100 μmol/L白藜蘆醇聯合MSU組較MSU組無顯著差異(t=0.19，P>0.05)(圖3)。

2.4 白藜蘆醇降低尿酸鹽晶體刺激痛風患者外周血單個核細胞NF-κB p65 mRNA水平

SIRT1在炎癥反應中通過作用于NF-κB的p65亞單位來抑制炎癥因子基因轉錄。本文研究發現空白對照組、MSU刺激組以及MSU聯合不同濃度白藜蘆醇組的NF-κB p65 mRNA水平存在顯著差異(F=32.02，P<0.001)；進一步比較發現，MSU刺激組的NF-κB p65 mRNA水平較空白對照顯著升高(t=7.65，P<0.01)，而NF-κB p65 mRNA水平在200 μmol/L和400 μmol/L白藜蘆醇聯合MSU組較MSU組顯著降低(t=6.25，6.00；P均<0.01)，而100 μmol/L白藜蘆醇聯合MSU組較MSU組無顯著差異(t=1.51，P>0.05)(圖4)。

3 討論

痛風病名中醫文獻早有記載，屬痹癥范疇，中醫對痛風病機的認識，多數認為本病的病機是“濕”和“熱”，治療用藥多以化濕、清熱為主。中醫藥治療痛風多為復合方劑，其中藥物種類復雜，各種藥物有效成分、作用機理不明確，甚至一些具有較大有毒成分，故亟需各種類似西藥具有明確藥理、毒理的中醫藥物。國外大量的研究證實白藜蘆醇是葡萄酒(尤其是紅葡萄酒)中最重要的功效成分之一，經現代西醫學研究已發現白藜蘆醇具有如抗腫瘤、降血壓、抗動脈硬化、抗血小板聚集、抗細菌和真菌感染、抗氧化、抗自由基、抗炎、退燒與止痛等多種藥理活性[12]。痛風急性發作期最常見中醫證型為濕熱蘊結證，白藜蘆醇具有清熱解毒、健脾胃的功效。研究表明白藜蘆醇對膠原誘導大鼠關節炎及骨關節炎均有良好的抗炎效果[2-3]，而且白藜蘆醇參與調節細胞信號通路發揮抗炎作用已成為近年來研究熱點。

白藜蘆醇，化學名3，5，4’-三羥基-反-1，2-二奔乙烯(3，5，4’-trihydroxystilbene)或稱芪三酚，廣泛存在于虎杖、花生、桑椹等各種植物中。研究表明，在痛風炎癥反應過程中伴隨大量的活性氧(ROS)的產生氧化過程，ROS能夠被核苷酸結合寡聚化結構域樣受體3 (NLRP3)炎性體識別，炎性體活化釋放促炎因子，引起炎癥反應[13]。環氧化酶2(COX-2)是氧化應激過程的主要成員之一，白藜蘆醇對急性痛風性關節炎模型大鼠有明顯的抑制作用，并呈一定的劑量依賴性，其作用可能是通過抑制IL-1β的分泌及關節滑膜NF-κB的表達，進而抑制炎癥過程中相關信號通路，減少炎癥因子及趨化因子的生成[2]。研究表明，SIRT1主要通過去乙?；傅幕钚园l揮其生物學功能，廣泛作用于各種轉錄調節子，如蛋白53(p53)、叉頭蛋白轉錄因子(FOXO)、解耦聯蛋白(UCP2)、NF-κB等[14-15]。SIRT1與不同的底物相互作用，發揮不同的生物學功能。有文獻報道[16]，白藜蘆醇能夠活化SIRT1通過去乙?；种芅F-κB轉錄活性來抑制NLRP3基因轉錄達到限制NLRP3炎性體活性，這可能是白藜蘆醇抑制痛風炎癥反應的機制之一。本文研究發現，急性期和間歇期痛風患者的SIRT1 mRNA和蛋白表達水平顯著低于正常對照者(圖1)，這與骨關節炎、骨質疏松、類風濕關節炎等常見風濕病的SIRT1低水平表達相一致[11]，提示痛風患者SIRT1低水平表達不能有效抑制MSU誘導的炎癥因子轉錄。值得注意的是，急性期、間歇期痛風患者SIRT1 mRNA均呈低表達且無明顯差異，但急性期痛風患者SIRT1蛋白水平較間歇期患者降低更明顯，急性期患者SIRT1基因與蛋白表達水平不一致，提示基因從轉錄到蛋白翻譯過程中，轉錄后調控、翻譯后調控等多種機制可能發揮了重要作用，例如微小RNA、甲基化、乙酰化等，需要更多的研究來進一步闡明其分子機制。

先前文獻報道[8]白藜蘆醇通過激活SIRT1調控下游基因轉錄，為進一步明確白藜蘆醇是否能改變痛風患者SIRT1水平及其變化特點，本文通過體外功能研究不同濃度白藜蘆醇干預MSU刺激間歇期痛風患者全血誘導急性炎性反應，檢測其外周血單個核細胞SIRT1水平，研究顯示MSU可下調SIRT1蛋白表達，而白藜蘆醇能夠從基因和蛋白水平上調SIRT1表達，且呈濃度依賴性(圖2)。本研究結果提示白藜蘆醇可能通過上調SIRT1表達參與抑制痛風炎癥反應。IL-1β作為痛風炎癥反應信號通路中關鍵細胞因子，其水平可反映痛風炎癥程度或強度，本研究檢測了下游促炎因子IL-1β蛋白在不同濃度白藜蘆醇干預MSU刺激間歇期痛風患者外周血單個核細胞中的變化，研究結果顯示白藜蘆醇能夠明顯抑制IL-1β蛋白水平，呈濃度依賴性(圖3)。根據文獻報道[2,9,16]，白藜蘆醇活化SIRT1后通過抑制NF-κB p65亞基活性發揮生物學功能。本文進一步檢測了NF-κB p65 mRNA水平發現，白藜蘆醇呈濃度依賴性抑制NF-κB p65 mRNA水平(圖4)，我們的結果進一步表明白藜蘆醇通過濃度依賴性抑制NF-κB信號通路來抑制痛風炎癥反應，之前的動物實驗結果也支持本文研究[2-3]。

綜上，白藜蘆醇呈濃度依賴性上調SIRT1水平抑制痛風炎癥反應，提示SIRT1是白藜蘆醇抑制痛風炎癥反應的作用靶點，這有助于更深入闡明白藜蘆醇參與痛風的炎癥調控機制及白藜蘆醇治療痛風奠定理論基礎，對痛風的診斷、治療和預防都具有重要意義。