Livin基因在喉癌組織的表達及siRNA對喉鱗癌細胞影響的研究

馮俊，李麗 ，楊久梅，莊元卓，彭濤,王朝莉

(1.川北醫學院第二臨床醫學院·南充市中心醫院耳鼻咽喉科；2.川北醫學院病理學教研室；3.川北醫學院分子生物研究所，四川 南充 637000)

喉癌是耳鼻咽喉科常見病、多發病，98%為鱗狀細胞癌，隨著環境污染加劇發病率有逐年升高的趨勢，位列我國頭頸惡性腫瘤第三位[1]。隨著技術的發展，基因治療成為晚期腫瘤患者的選擇之一。凋亡抑制蛋白家族中的成員之一，Livin(inhibitor of a apoptosis protein， IAPs)，與腫瘤細胞凋亡有關[2]。

1 材料和方法

1.1 細胞系

人喉鱗癌細胞株由華西醫學實驗中心惠贈；Lentivirus載體由川北醫學院組織與干細胞研究所贈送。

1.2 病例及標本

選用2012年10月至2016年3月川北醫學院第二臨床醫學院術后87例喉癌標本、79例癌旁組織(距腫瘤組織0.5 cm)作樣本。所有喉癌均經病理學確診為喉鱗癌細胞癌，癌旁組織未檢測出癌細胞。87例患者中，聲門型喉癌61例，聲門上型喉癌21例，聲門下型喉癌5例；男性82例，女性5例，年齡45～83歲，平均61.3歲；19例有頸淋巴結轉移；TNM分期：T1～T2級59例，T3～T4級28例。患者術前未接受放療或化療；組織分化程度：高分化鱗癌62例，中分化鱗癌21例，低分化鱗癌4例。所有標本送病理科固定保存備用。

1.3 試劑

RPMI-1640、Livin單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司、Opti-MEM I購自中國Takara公司；LipofectamineTM2000、GAPDH單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司； 自中國邁新公司購買MaxVisionTM試劑盒。PVDF膜購自美國Millipore公司；BCIP/NBT購自中國Takara公司。

1.4 Livin基因目標序列的選擇及siRNA的設計與合成

針對Livin基因序列(NCBI Reference Sequence:NM_022161.2)，按照siRNA序列設計原則[3-4]，設計出siRNA靶點序列(SH1-4)，同時設計一段序通用序列作陰性對照(NC)；經BLAST分析均不與任何人cDNA序列同源。siRNA慢病毒載體的構建及鑒定(另文敘述)。最佳靶點序列為BIRC7-SH2，質粒pLenOR-THM-Livin-SH2；正義鏈(SH2-F)：CGCGTCCCCGCCCTGTCCTAGGCCTGGACATTCAAGAGATGTCCAGGCCTAGGACAGGGCTTTTTGGAAA；反義鏈(SH2-R)：CGATTTCCAAAAAGCCCTGTCCTAGGCCTGGACATCTCTTGAATGTCCAGGCCTAGGACAGGGCGGGGA。陰性對照(NC)：CGCGTCCCCTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTGGAAAT

1.5 多核苷酸轉染喉鱗癌細胞

實驗分為SH2-R(反義鏈組)、SH2-F(正義鏈組)、NC (陰性對照)組。將生長良好的Hep-2約2×105，培養于多孔板中(6或12孔板)，于37 ℃ 5%CO2孵箱中備用。各取pLenOR-THM-Livin-SH2-R、pLenOR-THM-Livin-SH2-F、pLenOR-THM-Livin-SH2-NC及脂質體 2 000 加入Opti-MEM I中，于室溫下共育5 min。將核苷酸與脂質體2 000 于室溫下共育20 min，然后在孵箱中與Hep-2細胞作用，6 h后用PBS洗兩次，吸凈PBS，加入RPMI-1640培養液，在37 ℃ 5%CO2孵箱中24 h備用。

1.6 Western blot分析喉鱗狀細胞癌細胞Livin蛋白

取1.5所述的核苷酸轉移細胞1×106，以裂解液提取細胞總蛋白，根據Bradford法檢測蛋白濃度及確定液體積，取出PVDF膜(經甲醇活化)，在TBST中清洗1 min，然后用封閉液封閉過夜。用封閉液將對應的一抗Livin單克隆抗體稀釋成一定的濃度1∶200，內參GAPDH的稀釋終濃度為1∶3 000,室溫下共育1.5 h。用TBST清洗3次，每次5 min,加HRP標記的二抗。將 A試劑2 mL和 B試劑混合，滴在PVDF膜的正面，室溫孵育2 min，進入暗室，PVDF膜上蓋一層保鮮膜，擦去多余的發光劑。暗室膠片顯影、定影、掃描。

1.7 免疫組織化學染色

免疫組織化學染色參照MaxVision法。每張切片滴50 μL 3%H2O2孵育10 min,PBS沖洗3次，每次3 min，加入Livin單克隆抗體50 μL，孵育60 min，PBS沖洗3次，每次3 min，加入50 μL MaxVisionTM試劑，室溫孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3 min，每張切片滴加100 μL DAB,10 min后自來水沖洗，蘇木素復染。

1.8 免疫組化染色結果判定

免疫組化染色結果陽性以細胞胞漿內出現棕黃色顆粒為標準，染色細胞計數及染色強度據劉學軍等[5]介紹的方法進行。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 Livin蛋白在喉鱗癌組織中的表達和各臨床參數之間的關系

由表1可見，喉鱗癌組織中Livin表達陽性率為71.26%，顯著高于癌旁喉組織。由表2可見TNM分期中Ⅲ+Ⅳ期喉癌陽性表達率為89.28%，明顯高于TNM分期中Ⅰ+Ⅱ期喉癌；在喉鱗癌頸淋巴結轉移陽性者Livin陽性表達率高達73.68%，高于頸淋巴結轉移陰性者。Livin基因表達在不同性別、不同年齡、不同臨床分型間無統計學意義(P>0.05)。

2.2 Livin蛋白免疫組織化學結果

Livin蛋白陽性顆粒呈棕黃色,主要定位于喉癌細胞及淋巴細胞的細胞質內,喉癌細胞及淋巴細胞核和細胞間質都可見少量陽性染色。見圖1、圖2。

表1 Livin基因在喉癌組織和癌旁喉組織中的表達

表2 Livin蛋白的表達與各臨床指標的關系

2.3 Western blot分析各組的Livin蛋白表達

由圖3可見，SH2-R組的Livin蛋白相對表達量最低為(12.31±4.43)%；用SPSS 22.0 軟件分析各組蛋白表達灰度可以得出，SH2-R組與SH2-F、 NC組比較，P<0.05，有統計學意義。SH2-F、 NC組之間比較，P>0.05，差別無統計學意義。

3 討論

Livin是凋亡抑制蛋白家族成員之一，其基因位于人類第20號染色體q13．3上，包括7個外顯子和6個內含子，全長46 kb[6-8]。Livin抑制細胞凋亡的機制主要是：通過激活TAKI/JNK1信號轉導途徑抗凋亡；抑制caspase途徑：Livin能與caspase前體蛋白和其激活形式結合從而抑制其功能,阻斷其級聯反應從而抑制凋亡的進程，阻礙多種途徑誘導細胞死亡[9-11]。Yoon等[2]研究提示沉默Livin基因在喉咽鱗癌組織中的表達，可以抑制喉癌細胞的轉移及侵襲。Zhao等[12]研究顯示抑制Livin 在肺癌組織中表達，進而促進肺癌細胞的凋亡。Cho等[13]通過siRNA抑制肝癌細胞Livin的表達，顯示Livin基因與肝癌細胞的侵襲相關。因此，我們設計Livin siRNA作用于喉鱗狀細胞癌來減少Livin表達，進而分析能否增強喉鱗狀細胞癌細胞Livin蛋白的降低。

本研究顯示，喉鱗癌組織中Livin表達陽性率為71.26%，顯著高于癌旁喉組織(在癌旁組織中無表達)；喉鱗癌組織中Livin表達陽性率為71.26%，顯著高于癌旁喉組織。TNM分期中Ⅲ+Ⅳ期喉癌陽性表達率為89.28%，明顯高于TNM分期中Ⅰ+Ⅱ期喉癌；在喉鱗癌頸淋巴結轉移陽性者Livin陽性表達率高達73.68%，高于頸淋巴結轉移陰性者。Livin基因表達在不同性別、不同年齡、不同臨床分型間無統計學意義。用Western blott分析各組Livin蛋白時，SH2-R組的Livin蛋白相對表達量最低(12.31±4.43)%，這可能是由于SH2-R Livin多核苷酸抑制了Livin的表達，進而促使喉鱗癌細胞mRNA、Livin蛋白的降低；而SH2-F、 NC組的Livin蛋白表達量較高，這可能是由于SH2-F、NC組多核苷酸對Livin mRNA無抑制作用，故SH2-R組Livin蛋白與SH2-F、NC組間比較，有統計學意義。SH2-F、NC組間Livin蛋白比較，無顯著差異。本研究揭示SH2-R-Livin核苷酸在喉鱗癌細胞內可以減少Livin蛋白表達。

本研究結果表明，Livin基因在臨床分期Ⅲ+Ⅳ及頸部淋巴結有轉移者中高表達，而SH2-R Livin多核苷酸可以在體外使喉鱗癌細胞中Livin表達降低。接著我們會將SH2-R Livin多核苷酸作用喉鱗癌細胞及用于裸鼠移植瘤來進行體外體內研究其能否促進喉鱗癌細胞的凋亡，為將潛在的基因治療運用于喉鱗癌患者提供依據。