非對(duì)稱小干擾RNA沉默TACC2基因?qū)Y(jié)直腸癌增殖影響的研究

彭洪，林中超

(南充市中心醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合肛腸科，四川 南充 637000 )

結(jié)直腸癌在全世界范圍內(nèi)是排名第三的惡性腫瘤。每年有接近130萬(wàn)新診斷病例，并且每年有70萬(wàn)人因?yàn)榻Y(jié)直腸癌而死亡。雖然近年來西方國(guó)家結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率有所下降，但是在中國(guó)和其他一些發(fā)展中國(guó)家，發(fā)病率和死亡率卻有所上升。因此，闡明其具體作用機(jī)制對(duì)于結(jié)直腸癌的早期診斷和治療至關(guān)重要。

TACC2(transforming acidic coiled-coil proteins 2)是TACC蛋白家族成員之一，其主要位于中心體，可調(diào)控微管蛋白的形成和調(diào)控細(xì)胞有絲分裂，因此對(duì)于染色體的穩(wěn)定具有重要作用[1]。如果TACC2蛋白表達(dá)出現(xiàn)變化，可能導(dǎo)致基因穩(wěn)定性降低甚至形成腫瘤[2]。也有研究發(fā)現(xiàn)TACC2可與核組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶共同作用參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控[3]。有研究報(bào)道TACC2基因的高表達(dá)與乳腺癌和前列腺癌的發(fā)病密切相關(guān)[4-5]。然而TACC2基因在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系尚未見報(bào)道。

小干擾RNA(siRNA)可通過沉默目標(biāo)基因來發(fā)揮作用，近年有研究表明非對(duì)稱的RNA干擾(aiRNA)可提高靶基因的沉默效率。因此本研究采用非對(duì)稱RNA干擾技術(shù)抑制結(jié)直腸癌中TACC2基因的表達(dá)，探討TACC2在結(jié)直腸癌增殖中的作用和其可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 結(jié)直腸癌細(xì)胞系 人結(jié)直腸癌細(xì)胞系LoVo、HCT116及SW480細(xì)胞，均購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)研究所。

1.1.2 人體組織標(biāo)本 收集2016年至2017年南充市中心醫(yī)院行根治性手術(shù)的20例結(jié)直腸癌患者的癌組織標(biāo)本及匹配的癌旁正常組織，所有組織標(biāo)本均經(jīng)病理切片證實(shí)為原發(fā)性結(jié)直腸癌。所有結(jié)直腸癌手術(shù)患者術(shù)前未接受其他抗腫瘤治療。

1.2 方法

1.2.1 TACC2在結(jié)直腸癌和癌旁組織中的表達(dá) 將腫瘤組織和癌旁組織標(biāo)本粉粹后放于EP管中，加入細(xì)胞裂解液，混勻，冰置并離心后，收集的上清液為細(xì)胞總蛋白。

1.2.2 高表達(dá)TACC2蛋白的結(jié)直腸癌細(xì)胞系的篩選 蛋白免疫印跡法用于檢測(cè)人結(jié)直腸癌細(xì)胞系LoVo、HCT 116及SW480細(xì)胞中TACC2蛋白的表達(dá)，其具體操作方法參照前期文獻(xiàn)。Quantity One 軟件用于分析TACC2蛋白表達(dá)水平。結(jié)果提示LoVo細(xì)胞中TACC2蛋白的表達(dá)量最高，所以實(shí)驗(yàn)選擇LoVo細(xì)胞系用于后續(xù)研究。

1.2.3 TACC2 siRNA和aiRNA的設(shè)計(jì)和轉(zhuǎn)染 根據(jù)TACC2基因序列和小干擾RNA設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)TACC2 siRNA序列如下：sense 5’- GCU AAA GGU ACU UAC ACC UUG AUA-3’，antisense 5’- UAU CAA AGG UGU AAG UAC CUU UAG C-3’。同時(shí)設(shè)計(jì)合成與TACC2基因無同源性的陰性對(duì)照組siRNA-NC:sense 5’- CAA UAC GUA CUA UCG CGC GGA UTT-3’ ，antisense 5’-AUC AAA CGC GCG ATA GUA CGU ATT-3’。同時(shí)根據(jù)aiRNA的設(shè)計(jì)原理，將TACC2 siRNA正義鏈5’端進(jìn)行裁剪，設(shè)計(jì)了3條TACC2基因非對(duì)稱aiRNA，包括TACC2 aiRNA(17/24)，正義鏈為5’-GU ACU UAC ACC UUG AUA-3’， TACC2 aiRNA(18/24)，正義鏈為5’- GGU ACU UAC ACC UUG AUA-3’， TACC2 aiRNA(19/24)，正義鏈為5’- A GGU ACU UAC ACC UUG AUA-3’。委托廣州萊博生物科技有限公司合成。利用腺病毒將TACC2 siRNA，siRNA-NC，aiRNA(17/24)，aiRNA(18/24)和aiRNA(19/24)轉(zhuǎn)染入LoVo細(xì)胞。

1.2.4 熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)TACC2基因的表達(dá) 用PCR法檢測(cè)TACC2 siRNA，siRNA-NC，aiRNA(17/24)，aiRNA(18/24)和aiRNA(19/24)組細(xì)胞中TACC2基因的表達(dá)，具體操作步驟參考前期文獻(xiàn)。TACC2的上游引物：5’- AGC CAG CGA CCT GAA CCT-3’，下游引物： 5’- GAG GTC AGC ACA CAG CCA C-3’。GAPDH的上游引物：5’-CAT GCA GGC TAC CAT CCA TGT-3’ ，下游引物： 5’-GTT AGC AGT GAT GCC TAC CAA-3’。結(jié)果提示aiRNA(17/24)沉默TACC2基因的效果最強(qiáng)。采用相對(duì)定量比較CT值法分析數(shù)據(jù)。

1.2.5 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 將轉(zhuǎn)染TACC2 siRNA，siRNA-NC和aiRNA(17/24)的結(jié)直腸癌 LoVo細(xì)胞系以每孔2×104個(gè)接種于96孔板，每組4個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h及48 h后每孔加MTT 20 μL，4 h后棄上清液。然后每孔加二甲基亞砜(DMSO)150 μL震蕩10 min后于490 nm處測(cè)定吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次。

1.2.6 細(xì)胞周期檢測(cè) 將轉(zhuǎn)染TACC2 siRNA，siRNA-NC和aiRNA(17/24)的結(jié)直腸癌LoVo細(xì)胞以每孔2×105個(gè)接種于6孔板過夜，48 h后收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷的70%乙醇固定12 h后加入細(xì)胞染色液，按照說明進(jìn)行流式細(xì)胞分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 TACC2蛋白在不同組織中表達(dá)水平比較

蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)證實(shí)TACC2蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=53.67，P<0.05)。見圖1。

2.2 TACC2蛋白在不同結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)證實(shí)TACC2蛋白在LoVo細(xì)胞中的表達(dá)水平高于HCT116及SW480，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1022，P<0.05)。見圖2。因此實(shí)驗(yàn)選擇LoVo細(xì)胞系用于后續(xù)研究。

2.3 PCR檢測(cè)靶向抑制TACC2基因后的沉默效果

根據(jù)PCR實(shí)驗(yàn)原理，循環(huán)數(shù)CT值愈大則說明該基因的表達(dá)量愈低。結(jié)果顯示TACC2 siRNA-NC、aiRNA(17/24)、aiRNA(18/24)、aiRNA(19/24)、siRNA轉(zhuǎn)染到入HCT116細(xì)胞后TACC2基因△CT值發(fā)表為(2.25±0.02)、(5.53±0.04)、(4.52±0.13)、(4.41±0.06)、(3.77±0.04)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=942，P<0.05)。說明aiRNA(17/24)對(duì)TACC2基因的沉默效果最佳，故選擇aiRNA(17/24)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖3。

2.4 沉默TACC2基因?qū)?xì)胞增殖的影響

將TACC2 siRNA，siRNA-NC和aiRNA(17/24)轉(zhuǎn)染入LoVo細(xì)胞后，在24 h和48 h檢測(cè)細(xì)胞增殖能力(表1)。結(jié)果說明aiRNA(17/24)抑制LoVo細(xì)胞增殖的能力最強(qiáng)。

2.5 沉默TACC2基因?qū)?xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞儀對(duì)siRNA-NC，siRNA和aiRNA(17/24)這3組細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期分析，結(jié)果顯示aiRNA(17/24)可以明顯降低G0/G1期細(xì)胞比例，增加G2/M期細(xì)胞比例，從而使細(xì)胞阻滯在G2/M期。見圖4。

表1 LoVo細(xì)胞增殖能力

表2 細(xì)胞周期分析

3 討論

RNA干擾技術(shù)目前已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)和藥學(xué)研究領(lǐng)域的熱門。一般情況下RNA干擾是通過siRNA來實(shí)現(xiàn)的，其可特異性的降解同源mRNA，并可抑制目的基因的表達(dá)[6]。目前在細(xì)胞和臨床研究中使用的siRNA一般長(zhǎng)度都是19～21 bp，且兩條配對(duì)鏈長(zhǎng)度相等。然而2008年Sun等[7]提出不對(duì)稱RNA干擾技術(shù)(asymmetric interfering RNA，aiRNA)，其有更好的基因沉默效果，脫靶效應(yīng)更低，并且進(jìn)入腫瘤細(xì)胞更容易，因此具有更好的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)在上述理論的基礎(chǔ)上進(jìn)行，設(shè)計(jì)并合成了TACC2基因的特異性aiRNA如aiRNA(17/24)，aiRNA(18/24)和aiRNA(19/24)，將aiRNA與傳統(tǒng)的siRNA進(jìn)行對(duì)比，驗(yàn)證aiRNA是否能更有效的沉默結(jié)直腸癌LoVo細(xì)胞中的TACC2基因。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示基于TACC2基因的特異性非對(duì)稱aiRNA(17/24)能夠有效抑制結(jié)直腸癌LoVo細(xì)胞中TACC2基因的表達(dá)，其沉默效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)siRNA和其他兩種aiRNA，如aiRNA (18/24)和aiRNA(19/24)。

TACC蛋白家族有3個(gè)成員，包括TACC1，TACC2和TACC3，它們的基因定位在8p11，10q26和4p16。這3個(gè)TACC蛋白基因組區(qū)域在某些腫瘤中存在重排，因此在不同的腫瘤組織中它們的表達(dá)水平可能不同[8-10]。如TACC3在一些肺癌細(xì)胞株中高表達(dá)，但是其在卵巢癌和甲狀腺癌中的表達(dá)卻明顯降低[11-12]。在細(xì)胞有絲分裂期中TACC1在中心體上定位較弱，TACC2在中心體上定位較強(qiáng)，而TACC3在中心體及其附近都有較強(qiáng)的定位[13-14]。TACC1，TACC2和 TACC3定位的不同提示它們的功能可能存在差異。既往研究發(fā)現(xiàn)TACC2在乳腺癌和前列腺癌中明顯高表達(dá)，并且TACC2表達(dá)水平與臨床病理特征和患者預(yù)后密切相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)外源性TACC2可明顯促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增生，然而用siRNA沉默TACC2基因后則可明顯抑制前列腺癌細(xì)胞增殖[4-5]。到目前為止TACC2基因與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系并無相關(guān)報(bào)道。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)TACC2基因在結(jié)直腸癌中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，說明TACC2參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)TACC2蛋白在LoVo細(xì)胞中的表達(dá)水平高于HCT116和SW480細(xì)胞中的表達(dá)，當(dāng)用RNA干擾抑制TACC2基因的表達(dá)后LoVo細(xì)胞增殖能力明顯下降，提示TACC2基因可能作為一種癌基因促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生。

細(xì)胞周期調(diào)節(jié)紊亂是惡性腫瘤的重要生物學(xué)特征，它可導(dǎo)致惡性腫瘤細(xì)胞凋亡減少，腫瘤細(xì)胞無限制增殖和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，并且其也是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要作用機(jī)制。人類細(xì)胞中的TACC蛋白可與中心體結(jié)合影響細(xì)胞的有絲分裂，因此在細(xì)胞周期調(diào)控中扮演著非常重要的角色[15]。本研究發(fā)現(xiàn)沉默TACC2基因表達(dá)可改變結(jié)直腸癌LoVo細(xì)胞周期，G0/G1期細(xì)胞比例明顯降低，而G2/M期細(xì)胞比例則明顯提高，與既往研究結(jié)果相吻合[5]。G0/G1期是DNA合成前期，該期物質(zhì)代謝活躍，可快速合成RNA和蛋白質(zhì)。沉默TACC2基因表達(dá)后可使DNA合成前期的物質(zhì)代謝受到抑制，可能影響LoVo細(xì)胞的生長(zhǎng)。G2/M期是DNA合成后期和細(xì)胞分裂期，多種抗腫瘤藥物的作用機(jī)理均是使腫瘤細(xì)胞周期阻滯于G2/M期并最終引起細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)沉默TACC2基因后LoVo細(xì)胞增殖能力明顯下降，至少部分原因在于LoVo細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。

本實(shí)驗(yàn)通過RNA干擾抑制TACC2基因的表達(dá)后研究其對(duì)LoVo細(xì)胞增殖的影響極其作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)TACC2基因沉默后可誘導(dǎo)LoVo細(xì)胞周期G2/M期阻滯，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)既證實(shí)了非對(duì)稱aiRNA(17/24) 比傳統(tǒng)siRNA有更好的基因沉默效果，又表明了靶向抑制TACC2基因的表達(dá)可為結(jié)直腸癌提供新的基因治療策略。當(dāng)然關(guān)于TACC2基因影響結(jié)直腸癌的具體作用機(jī)制及與下游基因的調(diào)控關(guān)系還需要更加深入的研究。