針刺尿三針對BPH大鼠前列腺細胞凋亡的影響*

王梓楠，方浩泰，袁 青

(廣州中醫藥大學針灸康復臨床醫學院，廣州 510006)

良性前列腺增生癥(benign prostatic hyperplasia,BPH)是中老年男性最為常見的泌尿外科疾病之一。BPH的普遍性高，發病率隨年齡的增長逐漸上升。有文獻報道[1]，40～49歲群體BPH的發生率13. 8%，50～79歲群體BPH的發生率接近40%，80歲群體BPH的發生率超過80%，嚴重影響老年男性的生活質量。臨床以尿三針為主，根據臟腑經絡辨證配以相應配穴治療BPH具有顯著療效。目前，針刺治療BPH的臨床觀察研究頗多，肯定了針灸治療BPH具有顯著療效，這些研究多采用西藥治療作為對照組進行研究。如陳雷[2]等將針灸治療BPH與口服西藥進行對比，認為針灸治療療效優于口服鹽酸特拉唑嗪片。魏旭[3]等通過對針灸治療前列腺炎臨床文獻的研究，使用頻率最高的穴位與尿三針完全一致。本文旨在通過觀察尿三針對前列腺增生大鼠的前列腺濕重、前列腺指數(PI)、組織形態、前列腺細胞凋亡情況的影響，從細胞凋亡角度對尿三針治療BPH的相關機制進行探討，闡述針灸治療BPH的內在機制，為臨床針刺治療BPH提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 動物

成年雄性SPF級SD大鼠18只，體質量(270±20)g，由南方醫科大學實驗動物中心提供(質量合格證號SCXK(粵)2016- 0041)，飼養于廣州中醫藥大學青蒿研究所。

1.2 藥物與試劑

丙酸睪酮注射液(1 ml:25 mg)購于上海通用藥業股份有限公司(批號131208)；Tunel染色試劑盒購于羅氏公司(Roche，貨號11684817910)；蘇木素染液和伊紅染液購于碧云天公司。

1.3 儀器

倒置熒光顯微鏡由日本尼康公司生產(型號NIKON ECLIPSE ci-l)；成像系統(Nikon DS-U3)；光學顯微鏡由日本尼康公司生產(型號NIKON ECLIPSE ci)；成像系統(Nikon digital sight ds-fi2)。

1.4 方法

1.4.1 動物分組 將18只大鼠標記稱重后，隨機區組分為正常組、模型組、尿三針組3組各6只。

1.4.2 模型制備 模型組與尿三針組皮下注射丙酸睪酮5 mg/kg·d，連續28 d；正常組皮下注射相應體積的橄欖油，連續28 d，大鼠每天注射前稱重計算注射藥物量。

1.4.3 干預方法 造模完成后第1天即進行干預，將大鼠仰臥固定在固定器上，使用0.18×10 mm一次性無菌針灸針(華佗牌，蘇州，中國)，尿三針組針刺尿三針穴組，關元向下斜刺3 mm，中極向下斜刺3 mm，三陰交直刺3 mm，留針15 min，各穴每5 min捻轉1次，每日1次，連續21 d，模型組與正常組固定相同時間。

1.4.4 前列腺指數測定 于末次干預后，禁食12 h，稱空腹大鼠體重后以7%水合氯醛按0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉，大鼠麻醉成功后將其固定在手術臺上，手術完整摘取前列腺組織，去掉周圍脂肪組織。用電子天平精確測量前列腺濕重，計算大鼠前列腺指數：PI=前列腺濕重mg/大鼠體質量g。

1.4.5 tunel染色法檢測凋亡細胞 10%福爾馬林固定大鼠前列腺，石蠟包埋、切片。石蠟切片脫蠟至水，滴加蛋白酶K工作液(蛋白酶K儲存液用PBS1∶9稀釋)覆蓋組織，37℃溫箱孵育30 min。將玻片置于PBS(pH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min。切片稍甩干后滴加破膜工作液覆蓋組織，常溫下孵育20 min，將玻片置于PBS(pH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min。取tunel試劑盒內適量試劑1(TdT)和試劑2(dUTP)按2∶29混合，滴加覆蓋組織，切片平放于濕盒內，37 ℃水浴鍋孵育2 h，濕盒內加少量水保持濕度。切片用PBS(pH7.4)洗滌3次，每次5 min。去除PBS后滴加DAPI染液，避光室溫孵育10 min。玻片置于PBS(pH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片,切片于倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。結果DAPI染的細胞核在紫外線激發下為藍色，Roche試劑盒為FITC熒光素標記，陽性凋亡細胞核為綠色。應用Image-Pro Plus 6.0軟件選取標記相同的綠色熒光細胞核作為判斷所有照片陽性細胞的統一標準，選取標記相同的DAPI藍色細胞核為其他細胞，對每張照片進行分析得出每張照片陽性細胞數以及總細胞數。計算大鼠前列腺細胞凋亡率：凋亡率=陽性細胞數/總細胞數×100%。

1.4.6 HE染色法觀察前列腺組織形態 石蠟切片脫蠟至水，切片放入Harris蘇木素染3～8 min，用自來水沖洗，1%的鹽酸酒精分化數秒，再用自來水沖洗，0.6%氨水返藍，流水沖洗。切片放入伊紅染液中染色1～3 min,將染色后的切片脫水后用中性樹膠封片,切片于尼置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。結果細胞核等堿性物質染為藍紫色，細胞質及分泌物等酸性物質染為粉紅色。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 實驗動物脫落

實驗動物大鼠共18只，全部進入結果分析，無脫落。

2.2 各組大鼠前列腺濕重和前列腺指數情況

表1顯示，與正常組比較，模型組和尿三針組前列腺濕重及前列腺指數升高(P<0.05)；與模型組比較，尿三針組前列腺濕重及前列腺指數明顯降低(P<0.05)。

2.3 HE染色結果

圖1顯示，正常組大鼠前列腺上皮為單層柱狀或立方狀，腺上皮細胞排列整齊，細胞核位于基底部呈圓形，腺腔規則平整，腺腔內充滿大量粉紅染酸性分泌物，無纖維組織增生。模型組大鼠前列腺上皮細胞為高柱狀呈簇狀增生，排列緊密，細胞核變大呈圓形或橢圓形，可見腺上皮細胞增生向腺腔內形成凸起，腺腔變小甚至關閉，腺腔內無粉紅染酸性分泌物，有大量纖維組織增生。尿三針組大鼠前列腺上皮為柱狀，少量為高柱狀，部分排列整齊，細胞核呈圓形；腺上皮細胞增生向腺腔內形成少量凸起，腺腔輕度變小，腺腔內有粉紅染酸性分泌物稍減少，有少量纖維組織增生。

2.4 tunel染色法檢測各組大鼠前列腺細胞凋亡情況

表1圖2顯示，尿三針組的凋亡率明顯高于正常組與模型組(P<0.05)；模型組與正常組凋亡率比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 各大鼠前列腺濕重、前列腺指數及細胞凋亡情況比較

注：與正常組比較：aP<0.05；與模型組比較：bP<0.05

圖1 使用HE染色觀察各組大鼠前列腺組織形態(HE×100)

圖2 使用tunel染色法觀察個小組前列腺細胞凋亡情況(tunel×200)注：白色箭頭所指為凋亡細胞

3 討論

BPH是由于前列腺間質和腺體的增生而導致解剖學上前列腺體積增大、壓迫尿道，使尿道變形、狹窄，從而產生下尿路癥狀和膀胱高壓等尿動力學改變。膀胱壓力升高可導致膀胱、逼尿肌不穩定或失代償狀態，形成尿潴留甚至導致腎積水等繼發病癥[4-5]。BPH為老年性疾病，年老體弱或房勞傷腎，腎氣不足，命門火衰，致使膀胱氣化無權。現代人飲食不節易傷脾胃，后天脾胃運化水濕能力減弱；小腸失養則分清泌濁功能不足，濁液不能下輸尿道；肝主疏泄，疏泄不及則水液不出。肝脾腎調節功能下降與小腸分清泌濁功能不足是造成BPH的重要原因。

根據BPH的中醫病因病機，靳三針通過傳統針灸理論選取中極、關元、三陰交組成尿三針。中極為膀胱募穴，可調節膀胱氣化功能；關元為小腸募穴、足三陰經與任脈的交會穴，可調理小腸分清泌濁功能；中極、關元合用可調節尿液的生成、儲存與排泄。人體水液代謝的調節離不開肝脾腎的功能正常，故選取足三陰經交會的三陰交。三穴合用共同主持水液代謝的調節，促進膀胱氣化排出尿液，三穴合用體現了傳統針灸大道至簡的特點。臨床上運用尿三針為主治療老年性夜尿、尿潴留、尿失禁等各種泌尿系統疾病具有良好的療效[6-8]。

成功建立模型是實驗成功的關鍵。此前BPH模型的制備大多采用去勢皮下注射丙酸睪酮的方法，此方法去除大鼠睪丸，打破了大鼠體內雌/雄激素水平的生理性平衡，雄性激素分泌減少，雌激素占據主導。研究表明[9]，雌激素相對性增高可導致代謝相關性的前列腺增生。本實驗采用不去勢皮下注射丙酸睪酮的方法建立動物模型，更有利于研究BPH的針刺治療效果[10]。實驗結果中模型組的前列腺濕重與前列腺指數均高于正常組，差異有統計學意義，提示造模成功。

成功建立的模型可見明顯的前列腺間質和腺細胞增生[11]。研究證明[12]，前列腺增生與腺體內的細胞增生和凋亡相關，尤其是與細胞凋亡減少關系更加密切。“細胞凋亡”的概念是Kerr等于1972年首次提出[13]。細胞凋亡是內環境穩定的一種必要機制，是由基因控制的細胞主動死亡，又稱細胞程序性死亡。

本實驗中，尿三針組的前列腺濕重與前列腺指數均低于模型組且差異有統計學意義，尿三針組的細胞凋亡率明顯高于模型組和正常組，差異有統計學意義，說明尿三針能促進BPH模型大鼠的前列腺細胞凋亡，改善其增生情況。模型組的細胞凋亡率與正常組比較差異無統計學意義，在沒有尿三針干預時，BPH模型大鼠的前列腺細胞凋亡率與正常組相同，說明尿三針組的細胞凋亡并非是病理條件下自體損傷的一種現象，而是在針刺干預下機體為更好地適應環境主動爭取的一種死亡過程。HE染色觀察前列腺組織形態的結果中，尿三針組組織形態較模型組明顯改善，且接近正常組的前列腺組織形態，說明針刺尿三針能明顯改善BPH模型大鼠前列腺組織的形態改變，減少纖維組織增生，促進腺細胞酸性分泌物的釋放，具有修復前列腺功能的作用。

細胞凋亡在維持機體器官正常形態結構方面起十分重要的作用，在BPH的研究中是一個重要的研究方向。在成年后前列腺細胞的凋亡與增殖建立一個新的平衡，前列腺的體積大小維持在一定的值。50歲后由于細胞凋亡異常而導致前列腺體積開始增長[14]。Quiles[15]等研究指出，即使前列腺的體積增加了4倍，但其相比于對照組DNA的合成率仍然下降了約1/3，推測細胞凋亡異常導致BPH的可能性更高。已有研究表明，多種治療BPH的藥物可促進前列腺細胞的凋亡。潘恩山[16]的研究表明，益腎通膠囊能降低機體內Ki-67、Bcl-2/Bax、CD34表達水平，促進細胞凋亡；楊雪梅[17]等認為，阿克替苷能顯著抑制前列腺增生，其機制可能是通過調節Bcl -2和Bax的表達，從而促進良性前列腺增生的細胞凋亡；朱帥[18]等研究認為，癃暢顆粒可以下調大鼠前列腺增生組織中Survivin的表達，促進細胞凋亡。細胞凋亡減少是BPH發生的重要原因，如何促進前列腺細胞凋亡是治療BPH的關鍵。本實驗說明，尿三針治療前列腺增生的機理之一是促進前列腺細胞凋亡，從而使前列腺體積縮小、質量減輕，減輕前列腺炎癥及纖維化，從而起到治療作用。但尿三針促進細胞凋亡的分子機制仍需在下一步的實驗研究中從分子及基因水平驗證。