利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜快速鑒定產(chǎn)氣莢膜梭菌

汪琦，王紫薇，趙曉娟，李丹，曹嘉悅，馬丹，曾靜

(北京檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，北京,100026)

產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)屬革蘭氏陽(yáng)性產(chǎn)芽孢桿菌，在自然界中分布廣泛，是引起各種動(dòng)物壞死性腸炎、腸毒血癥和創(chuàng)傷性氣性壞疽的主要病原菌之一[1-2]。人食用了受該菌污染的食品，可能會(huì)發(fā)生食物中毒事件，出現(xiàn)腹瀉腹痛、嘔吐、不適等急性胃腸炎癥狀[3-4]。因此，快速準(zhǔn)確鑒定產(chǎn)氣莢膜梭菌對(duì)于有效防止該菌的污染及污染后病癥的防治具有重要意義。

目前，產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離和鑒定主要采取傳統(tǒng)檢測(cè)方法[5-7]，其中，最重要的生化鑒定實(shí)驗(yàn)為牛乳洶涌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，具有特征性鑒別意義[2,6-7]。 此外，VITEK的ANC卡(生物梅里埃)和16S rRNA基因測(cè)序也常用于產(chǎn)氣莢膜梭菌的鑒定[8-15]。

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)是新近發(fā)展起來(lái)的里程碑式的微生物快速鑒定技術(shù)。通過(guò)將待測(cè)微生物的特征蛋白指紋圖譜與已知微生物的特征蛋白指紋圖譜比對(duì)實(shí)現(xiàn)微生物的快速鑒定。相比現(xiàn)有檢測(cè)方法，該方法具有操作簡(jiǎn)單、快速、高通量、準(zhǔn)確度高和成本低等優(yōu)點(diǎn)。目前，該技術(shù)已成功運(yùn)用于各種細(xì)菌和真菌的鑒定[11-13,16-19]，國(guó)內(nèi)已利用該技術(shù)對(duì)銅綠假單胞菌、溶藻弧菌、洋蔥伯克霍爾德菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌等進(jìn)行了鑒定[20-23]，但在產(chǎn)氣莢膜梭菌鑒定方面的應(yīng)用還少有報(bào)導(dǎo)，只有黃永祿等用MALDI-TOF MS方法快速檢測(cè)了從地震傷員創(chuàng)面分離出的3株產(chǎn)氣莢膜梭菌[24]。

本文利用MALDI-TOF MS方法對(duì)51株產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株進(jìn)行鑒定并將鑒定結(jié)果與其他常用鑒定方法進(jìn)行比較，評(píng)估該方法是否適用于產(chǎn)氣莢膜梭菌的快速準(zhǔn)確鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC13124(A型)和ATCC12916(E型)購(gòu)于美國(guó)菌種保藏中心。標(biāo)準(zhǔn)菌株CVCC1125(A型)、CVCC58(C型)、CVCC59(C型)和CVCC81(D型)購(gòu)于中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。51株本實(shí)驗(yàn)室保存的產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株。

1.1.2 試劑

PCR引物，上海生工生物有限公司合成；rTaq酶、dNTP，日本Takara公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)，北京天根公司；α-氰基-4-羥基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid， CHCA)，美國(guó)Sigma公司；細(xì)菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品(bacterial test standard，BTS)，德國(guó)Bruker公司；甲酸，美國(guó)MREDA公司；乙腈(acetonitrile，ACN)，美國(guó)賽默飛世爾公司；三氟乙酸(trifluoroacetic acid, TFA)，美國(guó)ROE公司；無(wú)水乙醇，天津富晨；血平板，美國(guó)賽默飛世爾公司；厭氧產(chǎn)氣袋、ANC卡，法國(guó)生物梅里埃公司；液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(FTG)，北京陸橋公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Microflex LT基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，德國(guó)Bruker公司；VITEK 2 Compact，法國(guó)生物梅里埃公司；PCR儀，美國(guó)Applied Biosystems公司；Centrifuge 5424型臺(tái)式離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；Friocell 222L培養(yǎng)箱，德國(guó)MMM公司；厭氧盒，日本三菱公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化

將標(biāo)準(zhǔn)菌株和分離菌株劃線接種血平板，36 ℃厭氧培養(yǎng)18～ 24 h備用。

1.3.2 MALDI-TOF MS鑒定

1.3.2.1 細(xì)菌蛋白處理

常用細(xì)菌蛋白處理方式有2種，直接涂抹法和甲酸提取法。直接涂抹法：取少量新鮮培養(yǎng)物，直接涂布在靶板上，形成一均勻的薄層。待菌體干燥后，每個(gè)樣點(diǎn)覆蓋1 μL CHCA基質(zhì)溶液。干燥后上機(jī)鑒定。甲酸提取法：取適量血平板上的新鮮培養(yǎng)物，重懸于300 μL去離子水中。加入900 μL無(wú)水乙醇。渦旋振蕩后13 000×g離心2 min。倒去上清液，再次13 000×g離心1min。用槍頭吸棄上清，室溫干燥5 min。加50 ～80 μL 體積分?jǐn)?shù)為70%的甲酸溶液(甲酸的量可根據(jù)沉淀的量調(diào)整)，吹吸使沉淀充分溶解。加入等體積乙腈，渦旋振蕩后13 000×g離心2 min，取1 μL上清液點(diǎn)在靶板上，每個(gè)樣品點(diǎn)2個(gè)點(diǎn)。同時(shí)點(diǎn)1 μL BTS標(biāo)準(zhǔn)品溶液用于儀器的校正。室溫干燥后每個(gè)樣點(diǎn)覆蓋1 μL CHCA基質(zhì)溶液。干燥后上機(jī)鑒定。

1.3.2.2 上機(jī)鑒定

打開(kāi)FlexControl軟件，用BTS樣點(diǎn)校準(zhǔn)儀器。采集蛋白分子質(zhì)量范圍設(shè)為2 000～20 000 Da。用Biotyper RTC軟件進(jìn)行菌株圖譜信息的采集和自動(dòng)鑒定。

1.3.2.3 結(jié)果判定

布魯克MALDI-TOF MS系統(tǒng)的鑒定報(bào)告以鑒定結(jié)果和鑒定分值的形式體現(xiàn)。鑒定分值反映鑒定結(jié)果的可信度。其計(jì)算方法為在數(shù)據(jù)庫(kù)MSP中尋找待測(cè)樣品的峰，得到分?jǐn)?shù)A，在樣品圖譜中尋找數(shù)據(jù)庫(kù)MSP中的峰，得到分?jǐn)?shù)B，對(duì)比這些峰的峰高、頻率等信息，得到分?jǐn)?shù)C。A，B，C滿分為1分。鑒定分值為log10(1 000×A×B×C)。鑒定分值的判定標(biāo)準(zhǔn)為：2.300～3.000為可信的種水平的鑒定；2.000～2.299為可信的屬水平的鑒定，可能的種水平的鑒定；1.700～1.999為可能的屬水平的鑒定；0.000～1.699為不可信的鑒定結(jié)果。

1.3.3 VITEK 2 Compact系統(tǒng)鑒定

使用ANC卡進(jìn)行產(chǎn)氣莢膜梭菌的鑒定。用半量生理鹽水調(diào)整菌液濃度至2.8～3.3麥?zhǔn)蠁挝?，抽真空后上機(jī)鑒定。未鑒定為產(chǎn)氣莢膜梭菌的菌株需重復(fù)鑒定1次。

1.3.4 16S rRNA基因序列測(cè)定和比對(duì)

1.3.4.1 基因組DNA提取

從血平板上取適量的新鮮細(xì)菌培養(yǎng)物，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取DNA，- 20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4.2 16S rRNA基因擴(kuò)增和序列比對(duì)

16S rRNA基因擴(kuò)增的PCR反應(yīng)體系為：10×buffer (含1.5 mmol/L MgCl2)5 μL，dNTP(2.5 mmol/L each)4 μL，rTaq酶(5 U/μL)0.2 μL，引物(10 pmol/μL)，各2 μL，DNA模板1 μL，去離子水補(bǔ)充至50 μL。16S rRNA基因擴(kuò)增引物序列為L(zhǎng)PW58，5′-agg ccc ggg aac gta ttc ac-3′；LPW81，5′-tgg cga acg ggt gag gtt cga tac cag-3′。擴(kuò)增反應(yīng)條件為94 ℃ 3 min; 94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，40個(gè)循環(huán); 72 ℃ 5 min[10]。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度約1 200 bp。經(jīng) 1% 瓊脂糖凝膠電泳確定特異條帶后，送生工生物工程(上海)有限公司測(cè)序。利用Blast程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)將測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)。

1.3.5 牛乳洶涌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

按照GB4789.13的5.3.3操作。取血平板上的單克隆，接種FTG培養(yǎng)基，36 ℃厭氧過(guò)夜培養(yǎng)后取1 mL接種于含鐵牛乳培養(yǎng)基。46 ℃水浴中培養(yǎng)2 h后，每小時(shí)觀察1次有無(wú)“爆裂發(fā)酵”現(xiàn)象。5 h內(nèi)不發(fā)酵者為陰性。含鐵牛乳培養(yǎng)基使用鮮牛乳配制。每個(gè)分離菌株進(jìn)行2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)均為陰性的結(jié)果記為陰性。

2 結(jié)果與分析

2.1 MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果

2.1.1 樣品處理方法的選擇

對(duì)分離菌株進(jìn)行鑒定之前，先采用廠家提供的2種樣品處理方法(直接涂抹法和甲酸提取法)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的6株代表不同毒素類型的產(chǎn)氣莢膜梭菌標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行處理，比較樣品處理方法對(duì)鑒定結(jié)果的影響，并對(duì)MALDI-TOF MS方法的鑒定效果進(jìn)行初步確認(rèn)。

結(jié)果顯示，經(jīng)2種方法處理的標(biāo)準(zhǔn)菌株都被準(zhǔn)確鑒定為產(chǎn)氣莢膜梭菌。甲酸提取法的鑒定分值全部在2.300以上，達(dá)到了可信的種水平的鑒定。直接涂抹法41.67%(5/12)的鑒定分值在2.300以上，58.33%(7/12)的鑒定分值在1.800 ～ 2.300之間(表1)，表明直接涂抹法雖然有時(shí)能得到與甲酸提取法相當(dāng)?shù)蔫b定效果，但鑒定效果不穩(wěn)定。標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC13124經(jīng)甲酸提取法和直接涂抹法得到的MALDI-TOF MS圖譜見(jiàn)圖1。從圖譜也可看出，相比直接涂抹法，甲酸提取法得到的圖譜基線更平穩(wěn)，蛋白峰更多，重復(fù)性更好。因此，采用甲酸提取法對(duì)分離菌株進(jìn)行處理。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC13124直接涂抹法和甲酸提取法的MALDI-TOF MS圖譜Fig.1 MALDI-TOF MS spectra of the C. perfringensreference strain ATCC13124 using direct smear method andformic acid extraction method橫坐標(biāo)表示蛋白峰的荷質(zhì)比，縱坐標(biāo)表示蛋白峰的相對(duì)強(qiáng)度；A，B為直接涂抹法2次重復(fù)得到的質(zhì)譜圖；C，D為甲酸提取法2次重復(fù)得到的質(zhì)譜圖。

2.1.2 分離菌株的鑒定結(jié)果

51株分離菌株的新鮮培養(yǎng)物經(jīng)甲酸提取法處理后上機(jī)鑒定，均被鑒定為產(chǎn)氣莢膜梭菌且鑒定分值高于2.300，達(dá)到種水平的鑒定。鑒定結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2 VITEK 2 Compact鑒定結(jié)果

51株分離菌株經(jīng)VITEK鑒定，46株菌鑒定為產(chǎn)氣莢膜梭菌，4株菌為無(wú)法鑒定(Unidentified Organism)，1株為低分辨率(Low Discrimination)。將未成功鑒定的5株菌重新純化培養(yǎng)后再次鑒定，3株鑒定為產(chǎn)氣莢膜梭菌，2株(cp7和cp8)仍無(wú)法鑒定。比較這2株菌2次的生化反應(yīng)，結(jié)果完全相同，說(shuō)明這可能是VITEK數(shù)據(jù)庫(kù)中未收錄的生化型。VITEK鑒定結(jié)果詳見(jiàn)表2。

2.3 16S rRNA基因序列比對(duì)結(jié)果

51株分離菌株的DNA經(jīng)PCR后都可以擴(kuò)增出大小約為1 200 bp的目的片段。將測(cè)序所得序列在NCBI中做Blast比對(duì)，結(jié)果均為產(chǎn)氣莢膜梭菌(表2)。

2.4 牛乳洶涌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

牛乳洶涌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，32株菌2次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果皆為陽(yáng)性，15株菌2次實(shí)驗(yàn)中有1次結(jié)果為陽(yáng)性，4株菌(cp18，cp27，cp38和cp41)2次實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陰性。這4株菌的16S rRNA測(cè)序、VITEK和MALDI-TOF MS 3種方法的鑒定結(jié)果均為產(chǎn)氣莢膜梭菌(表2)。

表2 51株分離菌株的MALDI-TOF MS、16S rRNA序列比對(duì)、VITEK 2 Compact和牛乳洶涌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Identification results of the 51 isolated C. perfringens strains using MALDI-TOF MS, 16S rRNA sequencing,VITEK 2 Compact and iron-milk presumptive test

注：+代表牛乳洶涌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性；-代表牛乳洶涌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陰性。

3 討論

產(chǎn)氣莢膜梭菌是一種重要的致病菌，引起細(xì)菌性食物中毒的數(shù)量在美國(guó)排第2位[25-26]。在我國(guó)，生的肉制品、水產(chǎn)品中也存在較嚴(yán)重的產(chǎn)氣莢膜梭菌污染[3,27]。因此，快速準(zhǔn)確的鑒定方法對(duì)于產(chǎn)氣莢膜梭菌的日常檢測(cè)具有重要意義。

本文中，用新近發(fā)展起來(lái)的MALDI-TOF MS方法鑒定了實(shí)驗(yàn)室保存的51株產(chǎn)氣莢膜梭菌，并將鑒定結(jié)果與16S rRNA基因序列比對(duì)方法、VITEK方法和牛乳洶涌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)等3種常用方法進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，VITEK和牛乳洶涌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)在鑒定產(chǎn)氣莢膜梭菌時(shí)都出現(xiàn)了假陰性的結(jié)果，用MALDI-TOF MS方法鑒定產(chǎn)氣莢膜梭菌更加準(zhǔn)確(表2)。

VITEK 2鑒定梭菌屬細(xì)菌時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陰性的結(jié)果在多篇文獻(xiàn)中已有報(bào)道。AlMogbel用MALDI-TOF MS方法和VITEK2鑒定梭菌屬的144株菌并以16S rRNA測(cè)序方法為參考，結(jié)果發(fā)現(xiàn)16S rRNA測(cè)序鑒定為產(chǎn)氣莢膜梭菌的97株菌中，95株被MALDI-TOF MS方法鑒定為產(chǎn)氣莢膜梭菌，而VITEK 2只鑒定出78株。VITEK 2對(duì)144株梭菌屬細(xì)菌鑒定的正確率為77.7%(112/144)，錯(cuò)誤率為9.7%(14/144)，12.5%(18/144)的菌無(wú)法鑒定[11]。有些研究報(bào)道的VITEK 2鑒定梭菌屬細(xì)菌的正確率甚至更低，只有44.4%和64.3%[8-9]。

樣品處理方式會(huì)影響MALDI-TOF MS方法的鑒定結(jié)果。CHEAN用布魯克的MALDI-TOF MS系統(tǒng)對(duì)52株梭菌屬的菌株，包括30株產(chǎn)氣莢膜梭菌和22株梭菌屬的其他菌種進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明直接涂抹法處理后鑒定正確率只有69.2%，而甲酸提取法處理后鑒定正確率為100%[12]。本實(shí)驗(yàn)中，也采用這2種常見(jiàn)的樣品處理方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行處理，鑒定結(jié)果表明，樣品處理方法對(duì)鑒定結(jié)果的影響主要體現(xiàn)在鑒定分值上。直接涂抹法操作簡(jiǎn)單，雖然有時(shí)也可以得到2.300以上的鑒定分值，但是由于涂抹的菌量和均勻程度很難把握，直接導(dǎo)致采集到的圖譜質(zhì)量不穩(wěn)定，鑒定分值的差異較大(表1和圖1)。總體來(lái)說(shuō)，甲酸提取法的鑒定結(jié)果在穩(wěn)定性和重復(fù)性上都高于直接涂抹法。選用甲酸提取法可以保證MALDI-TOF MS的鑒定結(jié)果更準(zhǔn)確。

除了準(zhǔn)確性，在檢測(cè)成本和速度上，MALDI-TOF MS方法也具有不可比擬的優(yōu)勢(shì)。VITEK檢測(cè)1個(gè)菌株的成本在30～40元左右，大約需要8 h。而且在檢測(cè)前需要對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏染色從而選擇相應(yīng)的檢測(cè)卡。而MALDI-TOF MS方法不需要知道菌株的相關(guān)信息，檢測(cè)1個(gè)菌株的成本大約為1～2元，0.5 h內(nèi)可以得到鑒定結(jié)果。與傳統(tǒng)的牛乳洶涌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)相比，MALDI-TOF MS方法不僅檢測(cè)時(shí)間大大縮短，從6～7 h縮短至0.5 h內(nèi)，而且結(jié)果穩(wěn)定，便于判斷。由于成本低，操作簡(jiǎn)單，在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，還可以通過(guò)篩選更多的可疑菌落提高鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

綜上，相比傳統(tǒng)檢測(cè)方法，MALDI-TOF MS方法操作更簡(jiǎn)便、成本更低廉，檢測(cè)時(shí)間更短，而且結(jié)果更加準(zhǔn)確，可以作為產(chǎn)氣莢膜梭菌日常檢測(cè)的有效工具。