中國傳統發酵食品微生物多樣性及其代謝研究進展

解萬翠，尹超，宋琳，許志穎，于文露，賈俊濤, 趙宏偉，張俊逸，李鈺金，楊錫洪*

1(青島科技大學 海洋科學與生物工程學院,山東 青島,266042) 2(青島海關出入境檢驗檢疫局，山東 青島，266002) 3(青島信和源生物科技有限公司，山東 青島,266002) 4(泰祥集團,山東省冷凍調理食品加工技術企業重點實驗室，山東 榮成,264303)

發酵是古老的食品加工和保存方式之一[1]，在有益微生物及其酶的作用下，食品原料中的糖、脂質和蛋白質等主要的營養物質被分解，轉化為原料在發酵前所不具有的特殊風味及營養成分。傳統發酵食品在中國有著悠久的歷史，是中華飲食文化的重要體現，漫長的發展歷史造就了其原料多樣、產品種類繁復[2]，如酒類、發酵調味品等，其原料及產品主要風味特點如表1所示。

表1 常見傳統發酵食品原料及主要風味特點Table 1 Sources of traditional fermented foods products

傳統發酵食品生產過程中，各種微生物在原料中自發地富集，從而逐步形成一個較為穩定的菌群及生態環境，原材料在這種發酵環境下，生產人們所期望的食物，在食物中產生新的能夠促進人體健康的化合物，同時去除具有不利健康潛力的物質[3]，因此微生物被認為是決定發酵食品品質好壞的關鍵因素，且傳統發酵食品的發酵系統是相對開放的環境，致使其蘊藏有豐富的微生物資源，在長期的發酵馴化過程中，篩選保留下了豐富優良的菌相資源。為揭示微生物在食品發酵過程中的發酵機理，目前的許多研究聚焦于發酵食品微生物多樣性及其結構演替規律，以期對今后發酵食品的工業化、標準化等提供理論依據。本文重點綜述了不同傳統發酵食品中菌相結構、演替規律及其代謝規律，并對發酵食品未來研究方向進行展望。

1 傳統發酵食品中微生物的多樣性和演變

傳統發酵食品產品質量特性會因環境和人為因素的不同而有所差異，其中復雜的菌相組成使得人們無法有效地對發酵食品中微生物的多樣性及其結構在發酵過程中的演替規律進行分析，傳統可培養方法無法滿足人們對發酵食品中微生物多樣性的研究，而隨著分子生物學和生物信息學的快速發展，非培養方法如微生物組學等技術可以有效地揭示微生物是如何影響食品發酵過程的。

自20世紀90年代，非培養的研究方法逐漸被應用于食品發酵微生物的研究領域，如濃度梯度凝膠電泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electro phoresis, PCR-DGGE)法使用較為廣泛，使用PCR-DGGE對發酵食品中菌相研究的論文數量從20世紀90年代以后呈指數狀態增長，通過對這些論文的研究結果分析，PCR-DGGE能夠有效地分析發酵食品中微生物的多樣性及菌相結構演替規律[4]。近年來，隨著測序技術的發展及成本的降低，高通量測序越來越多地應用于檢測發酵食品中微生物基因組，以揭示其組成及演替規律。實驗方法的進步推進了對傳統發酵食品中復雜微生物菌群結構變化的研究。

1.1 傳統發酵豆制品

傳統發酵豆制品是亞洲的特色食品，其歷史悠久、種類繁多。豆豉、豆醬、腐乳、醬油等是中國傳統發酵豆制品的典型代表。傳統發酵豆制品的生產過程一般被認為是在開放環境下進行的，導致其菌相組成復雜多變。發酵原料在發酵過程中發生一系列復雜的生化反應，不僅賦予了其獨特的風味，同時提高了豆制品的功能性和保健功能。普遍認為，在豆制品發酵過程中，微生物及其分泌的胞外酶對其風味物質的產生、營養物質的變化及食品質地的形成等都有著至關重要的影響。

參與發酵的菌相復雜，既包括有利于發酵的菌種，也包括導致腐敗甚至對人有害的菌種，因此分析其發酵過程中菌相結構變化，揭示微生物種類和遺傳的多樣性，可對傳統發酵豆制品的發酵調控及品質提高有重要的指導意義。LI[5]等通過高通量測序的方法對中國傳統豆類發酵食品-豆瓣醬中的微生物菌落結構進行了分析，結果表明除去乳桿菌屬和不動桿菌屬在發酵過程中發生劇烈變化外，其他菌種相對穩定；在豆瓣醬中的優勢微生物只包括四聯球菌(Tetragenococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和鏈球菌屬(Streptococcus)。耿予歡[6]等采用了PCR-DGGE(變性梯度凝膠電泳)指紋圖譜技術，系統地分析了高鹽稀醪發酵工藝生產的廣東醬油發酵過程中微生物組成的變化趨勢，結果發現在醬油釀造的過程中微生物結構組成呈現出由復雜到簡單的演替規律，醬油高鹽的生產發酵環境對大多數細菌有著較強的抑制作用。同樣，對豆豉和腐乳中菌相組成的研究結果分析可知，豆豉中參與發酵的芽孢桿菌的主要優勢微生物是枯草芽孢桿菌[7]，而腐乳中主要優勢微生物為枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌[8]。

1.2 傳統發酵乳制品

內蒙、西藏和新疆等地區的傳統發酵乳是中國傳統發酵乳制品的典型代表。傳統的發酵乳制品表現出明顯的地理性特征，微生物的種群結構和數量與當地的氣候、環境以及奶源等因素相關[9]，對奶酪等傳統發酵乳制品的微生物菌群結構的研究不僅能夠揭示其發酵原理，更好地對發酵進程和品質進行控制，還可能有助于其產地溯源系統的建立。

智楠楠[10]等利用Illumina Miseq深度測序對7個地區的9種酸奶樣品中的微生物組成進行了研究分析，結果顯示酸奶中細菌主要為厚壁菌門，而對細菌組成屬水平進行分析發現鏈球菌屬(Streptococcus)為主要的優勢微生物，占87.1%，其次為乳桿菌屬(Lactobacillus) 僅占10.3%；楊潔等[11]對從新疆采集的22個酸奶樣品中乳酸菌菌種構成進行了研究，結果顯示德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.)為主要的優勢菌，占82%。對傳統發酵酸奶中主要優勢菌群的檢測結果顯示，不同地區、不同奶源也會對酸奶中微生物菌群結構有著明顯的影響，如張敏[12]等運用高通量測序技術，對新疆克孜勒蘇柯爾克孜自治州和塔城地區不同奶源及其發酵乳產品的7 種乳品中菌相結構進行了分析，結果顯示地區和奶源的不同對發酵乳產品中的菌相組成有著顯著的影響。對獲得歐盟原產地保護的意大利Ragusano地區奶酪中微生物菌群結構的研究顯示乳桿菌屬、乳球菌屬、腸球菌屬和明串珠菌屬是主要的優勢菌群，同時檢測出低水平的假單胞菌屬和酵母菌，而從未檢出大腸桿菌、單核細胞增生李斯特氏菌和沙門氏菌，說明奶酪發酵條件有效地抑制了有害菌的生長和繁殖[13]。發酵乳制品中微生物復雜多樣，不同乳制品菌種同質化程度較低，代謝產物不盡相同，工業生產過程中根據代謝機理進行發酵工藝控制顯得尤為重要。

1.3 傳統發酵糧食產品

1.3.1 食醋

山西老陳醋、鎮江香醋是中國傳統發酵谷物類食品的典型代表，且早已實現工業化生產，它們的生產是一個相對開放的環境，有眾多的微生物參與其中，這就造成了其復雜的微生物結構組成，現代分子生物學方法的應用可以有效地對不同發酵階段菌相組成及其演替規律進行分析。

山西老陳醋的生產發酵過程主要分為制曲、糖化、酒精發酵和醋酸發酵四步，不同階段因為釀造工藝的原因，菌相結構會發生劇烈變化，NIE[14]等對不同階段中不同發酵天數的樣品進行微生物鑒定統計，結果顯示不同階段微生物的菌群結構存在著顯著的差異性。從整個發酵過程中看，大曲到酒精發酵期間，細菌和真菌多樣性是呈現減少的趨勢，而醋酸發酵前期菌群數量由于醋醅的接入而增加，但隨著發酵的進行乳酸菌和醋酸菌占據優勢，抑制其他微生物的生長，從而使菌種數量下降；為解析鎮江香醋醋酸發酵階段醋醅中主要功能微生物的演替規律，陶京蘭等[15]建立了有效的實時熒光定量PCR方法，對主要的優勢微生物進行定量分析，結構發現醋醅中優勢微生物為醋酸菌、乳酸菌和酵母，三者就占細菌和真菌總和的80%以上，在醋酸發酵階段醋酸菌和乳酸菌數量均呈現出先增加后降低，而后保持一定水平直至發酵結束的趨勢。

1.3.2 酒類

傳統發酵酒類主要有黃酒、米酒、白酒等酒種。我國發酵酒歷史悠久，具有獨特的發酵工藝和豐富的酒體。“曲是酒之骨”，充分說明了在白酒釀造生產過程中微生物所起到的至關重要的作用，酒中特殊風味的產生及營養成分的變化受曲中的菌相組成的影響，因此很多學者專家在釀酒功能菌篩選、鑒定、應用上做了大量的研究。

王莉等[16]采用高通量測序技術分析了醬香型白酒發酵窖池中不同階段的窖底泥及環境土樣中的細菌結構組成，結果發現與窖底泥中的細菌組成相比，酒廠周圍環境土壤中的細菌組成更為豐富多樣，說明在土壤被逐漸馴化成酒廠中窖底泥的進程中，細菌種類多樣性逐漸下降，逐漸形成以乳桿菌科(Lactobacillaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)和瘤胃菌科(Ruminococcaceae)等厭氧微生物為主的優勢菌群。而雷振河等[17]分析了釀造清香型白酒所用大曲以及酒醅中的菌相組成，酒醅中優勢細菌主要包括腸桿菌科、醋酸桿菌科等占原核微生物70 %以上，優勢真核微生物主要包括雙足囊菌科、假絲酵母和畢赤酵母科等。

1.4 傳統發酵水產食品

發酵水產食品主要是指通過在新鮮魚、蝦、蟹、貝類等水產品中加入較高含量的食鹽，然后經過微生物長時間發酵而成的食品，主要包括蝦油、蝦醬、魚醬油、魚露等。不同地區傳統蝦醬中微生物組成因地區和制備工藝以及原料的不同而存在差異，如印度尼西亞傳統蝦醬中參與發酵的主要乳酸菌是片球菌屬(Pediococcushalophilus和Pediococcusdextrinicus)[18]，而戴玲瑛[19]通過高通量測序技術對蝦醬中細菌群落結構及多樣性進行剖析發現，發光桿菌屬是主要的優勢菌屬，所占比例達到71.94%；其次是弧菌屬，比例為12.54%。此外，嗜鹽菌[20]以及產蛋白酶霉菌和酵母菌[21]等有利于改善快速發酵蝦醬風味的微生物均被分離鑒定而用于蝦醬快速發酵技術改進和推進其工業化的研究中。同樣，在魚露生產過程中研究者們也通過對魚露發酵過程中菌相結構變化規律的研究，從而選用耐鹽細菌作為發酵劑或通過添加蛋白酶以達到縮短魚露發酵周期、提高魚露產品質量的目的[22]，黃紫燕[23]對不同發酵階段傳統發酵工藝制作的魚露中微生物的菌相組成進行了剖析，證實了乳酸菌以及酵母菌是主要的優勢微生物，結合各項理化指標及游離氨基酸的變化規律進行分析發現，乳酸菌和酵母菌的變化趨勢與各項指標的變化規律有明顯的相關性。發酵技術在水產品加工中的應用，可以有效地利用低值水產品生產高值化食品，對水產品的利用以及有效的保存都有很大的促進作用[25]。傳統發酵中微生物多樣性及其群落結構動態化變化的研究，可以有效地設計發酵劑和優化發酵條件以實現其工業化生產。

2 傳統發酵食品微生物的代謝特點

傳統發酵食品具有獨特的風味和豐富的營養成分，且某些發酵食品中生物活性物質對人體健康有著積極的作用，其獨特的風味及營養成分主要是原材料在微生物及酶的作用下轉化形成的，其發酵過程及物質轉化概述如圖1所示，而在發酵過程中微生物的代謝對發酵食品中的生物活性物質、食品特征以及風味等起著關鍵作用，因此對傳統發酵食品中微生物代謝的研究能夠更好地揭示微生物在發酵過程中的主要作用，分析微生物與代謝物之間的關系可以更好地掌握微生物發酵機制，對產品的質量控制和工業化提供理論依據[3]。

圖1 發酵食品發酵過程及物質轉化概述[2]Fig.1 Overview of the fermentation process andtransformation of fermentation foods

通過分析發酵食品菌相組成與代謝物之間的相關性，從而找到發酵體系中的功能微生物群[26]，這種方法是尋找復雜發酵系統中核心微生物群的主要方法之一。如WU[27]等為了研究鎮江香醋中微生物群落代謝形成風味的機制，利用高效液相色譜-紫外檢測法(HPLC-UV)和頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜(HS-SPME/GC-MS)對樣品中成分進行檢測，通過宏基因組測序揭示微生物分類和功能組成，構建了香醋中微生物群對底物分解和主要風味形成的代謝網絡，以及分析了不同代謝途徑的微生物分布差異；王鵬[28]等為揭示白酒發酵過程中核心微生物群，通過計算白酒發酵過程中豐度占比前20的細菌屬及真菌屬與61種代謝物之間的Spearman相關系數，發現在白酒酒醅發酵過程中，比較重要的代謝產物貢獻者是Lactobacillus、Saccharomyces和Candida；對奶酪中微生物菌群結構和數量研究的基礎上，通過氣相色譜-質譜聯用技術(GC-MS)等檢測手段對奶酪中的風味物質檢測，通過統計學數據分析建立起了微生物與代謝產物之間的聯系(見表2)，對奶酪發酵工藝改進提供了理論支撐。蟹膏[29]、魚醬[30]以及食醋[31]等傳統發酵食品中微生物代謝特點或核心功能微生物也通過這種方法進行了研究。微生物代謝特點的研究及核心微生物的尋找可以對研究者采用工程化的理念設計出高效的多菌種體系提供理論基礎[32-33]，從而構建出可控的多菌種發酵體系，實現傳統發酵食品的高效而有目的性的生產。

表2 奶酪中微生物與代謝物之間的關系[13]Table 2 The relationship between microbes and metabolites in cheese

3 傳統發酵食品微生物組學及其代謝的研究方法

在過去幾年中，宏基因組和宏轉錄組測序被廣泛地應用于發酵食品微生物組成及代謝的研究中，蛋白質組檢測技術也出現在發酵食品代謝的相關研究論文中，應用這些組學技術并結合代謝組學分析，為深入地解析發酵食品中微生物組成及物質產生的分子機制提供了重要的方法技術支撐[34]。

3.1 宏基因組

基于高通量測序技術的宏基因組測序技術已經廣泛地應用于包括發酵食品在內的各種環境微生物群落結構的研究中。與普通的rRNA測序不同，宏基因組測序是通過對環境中全部微生物進行提取總DNA，然后通過構建相關的基因組文庫，采用基因組學的研究方法對環境樣品中全部微生物的DNA組成及其群落特點進行研究，能夠更好地揭示環境中微生物豐度，對豐度較低的微生物也能有效地檢出，同時有利于新物種的發現[35]。

LI[36]等通過16S rRNA基因的高通量測序比較了4種中國不同省份面團發酵起始劑樣品以及不同發酵階段面團中的細菌群落，實驗結果能夠揭示出不同省份樣品的差異性以及發酵過程中細菌群落的演替，通過分析注釋之后，宏基因組檢測也可以解析可能有助于風味物質產生的功能基因簇和途徑[37]。

3.2 宏轉錄組

同樣基于高通量測序技術的宏轉錄組測序是針對活躍表達的基因的轉錄組，通過逆轉錄后得到cDNA序列，并對其進行測序。相較于宏基因測序技術，宏轉錄組測序能夠直接對微生物在特定時間和區域表達活躍的基因進行檢測，更加有效地解析微生物代謝與風味物質產生之間的關系。JUNG[38]在泡菜29 d的發酵過程中，從5個時間點取樣提取總mRNA，使用Illumina GA IIx對表達的mRNA序列進行測序，結果表明在發酵早期Lac.mesenteroides的基因表達過程最為活躍，而Lb.sakei和W.koreensis的基因在發酵后期表達活躍，同時發現與碳水化合物轉運和水解乳酸有關的許多基因被大量表達，實驗結果有助于了解乳酸菌在發酵泡菜中的代謝相關基因的表達情況以及乳酸菌在不同發酵階段菌種活躍情況。

3.3 宏蛋白質組

2004年，RODR GUEZ-VALERA提出了宏蛋白質組(metaproteome)的概念，即環境中所有生物的蛋白質組的總和[39]，宏蛋白質組的研究方法與傳統的蛋白質組研究方法相似，其流程一般包括蛋白質樣品制備、蛋白分離和蛋白鑒定等。采取合適的蛋白質提取方法、分離程序和先進的串聯質譜法，宏蛋白質組學揭示了微生物群體中的主要功能蛋白質。宏蛋白質組學早已應用于各種環境微生物生態系統功能的研究中，但是多數發酵食品含有較高的蛋白質，對宏蛋白質組學應用于發酵食品微生物研究是一個不小的挑戰。JI[40]等采用宏蛋白質組學方法對中國傳統發酵魚中的2 175個蛋白進行鑒定和注釋，這些蛋白質屬于19個門553個菌株，其中包括10個乳酸菌菌株，基于KEGG注釋系統，發現1 217個蛋白質參與代謝途徑，其中352個蛋白與氨基酸代謝相關，在鏈球菌屬、芽孢桿菌屬、埃希氏桿菌屬和假黃單胞菌屬中鑒定了63種氨基酸降解相關蛋白，表明這些菌株可能是產生芳香化合物的菌種，宏蛋白質組學信息加深了對發酵魚中微生物代謝模式的理解，可為改進發酵魚的穩定性和適口性提供理論依據。對食醋發酵過程中宏蛋白質組采用2D-DIGE和質譜法進行研究，結果表明，大多數蛋白質在功能上與應激反應，TCA循環以及不同的代謝途徑有關；宏蛋白質組學也在普洱茶和中國白酒等發酵食品中微生物組成及代謝的研究中[41]得到應用。

4 結論及展望

中國的傳統發酵食品種類繁多，但是大部分仍沿用傳統的生產工藝，存在生產規模較小、工藝粗糙、發酵過程不可控、發酵周期較長、而且極易受外界環境的影響，使產品質量很不穩定，從而帶來一定的食品安全問題等，嚴重制約了傳統發酵食品的發展。對微生物結構組成及演替規律、發酵代謝機理及規律進行詳細的研究總結，可以更好地開發傳統發酵食品，對推進傳統發酵食品的產業化具有極其重要的意義。