pH調節法提取三種貝類分離蛋白及其組成、特性分析

薛高瞻，張凱，鄭堯，鄭惠娜，周春霞，高加龍，秦小明，章超樺

(廣東海洋大學 食品科技學院，廣東省水產品加工與安全重點實驗室，水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室，國家貝類加工技術研發分中心(湛江)，廣東 湛江，524088)

自2002年以來，中國的水產養殖一直處于世界領先地位[1]。近年來隨著人工繁殖和工程技術的不斷發展，中國貝類水產養殖生產量持續增加。中國每年生產大約1 200～1 300萬t各種貝類(約占漁業水產養殖總產量的28%)，占世界水產養殖總產量的60%[2-3]。我國水產品加工仍處于起步階段，特別是貝類加工更為落后，即使是生產和出口量較大的主要經濟貝類，大多也處于初加工階段，產品形式單一、高附加值產品比例低[4-5]。因此，貝類高附加值集約加工和綜合利用問題已成為水產貝類加工行業的制約瓶頸。

pH調節法提取動物蛋白是20世紀90年代末新興的一種技術，該方法是利用蛋白質在不同pH條件下溶解度不同的原理，首先在堿性條件下將肌肉中的蛋白質溶解，去除不溶物，再調 pH至蛋白質的等電點沉淀蛋白[6]。已有許多研究報道采用pH調節法從魚肉，雞肉、牛肉、兔肉中有效提取回收高質量的蛋白質[7-8]。pH調節法是一種從動植物提取分離蛋白的有效技術，提取的分離蛋白可作為一種優良的膳食補充劑，也可用作生產重組產品的粘合劑、分散劑、乳化劑、即食產品等，同時其能夠與其他蛋白質的相互作用保留凝膠形成能力[9-12]。分離蛋白的組成和特性在食品加工和產品研發過程中十分重要[13]。海洋貝類是海產蛋白質的重要來源，具有高蛋白、低脂肪的特點。目前，大部分研究主要采用酶解方法[14-15]，采用pH調節法制備貝類分離蛋白及其組成和特性分析的相關研究較少。我國貝類蛋白資源豐富，但是加工利用程度低，高附加值產品少。因此，本文采用pH調節法從3種經濟養殖貝類：扇貝、文蛤和鮑魚肌肉中提取制備3種貝類分離蛋白，確定堿提和酸沉最佳pH，進一步分析3種貝類分離蛋白的組成和特性，研究結果為貝類分離蛋白作為高品質營養蛋白質基料應用于保健食品生產工業中提供理論基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

墨西哥灣扇貝(Argopectenirradiansconcentricus)、文蛤(MeretrixmeretrixLinnaeus)和皺紋盤鮑(Haliotisdiscushannai)購于廣東省湛江市東風市場。采用泡沫箱包裝，3種貝類鮮活貯運至實驗室，立即去殼去內臟、清洗干凈，將貝肉分裝于保鮮密封袋中，-20 ℃儲存備用。聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑盒和蛋白質標準品購于上海碧云天生物科技有限公司(中國上海市)；其他化學品和試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

pH-25數顯pH酸度計，上海康儀儀器有限公司；UXZ200H島津托盤電子分析天平，日本島津公司；Milli-Q Biocel超純水系統，美國 Millipore 公司；T18 basic高速分散機，德國IKA公司；Sigma 3K3離心機，德國 Brawn Biotech International公司；日立835-50型高速氨基酸分析儀，日本日立公司；EVO 300 PC紫外可見分光光度計，美國 Thermo Fisher Scientific公司； DYCZ-24 EN電泳槽，北京六一儀器廠；DYY-2C電泳儀，北京六一儀器廠；凝膠成像儀，美國 Bio-Rad公司；204-DSC，德國 Netzsch 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 最佳堿溶及酸沉pH的確定

參考CHEN等[16]提取分離蛋白方法并略加修訂。整個提取過程在冰浴中進行。首先按1∶3(g∶mL)將貝肌肉分散在預冷(4 ℃)的超純水中，采用1 mol/L NaOH將溶液的pH分別調節至8.0、9.0、10.0、11.0、12.0和13.0。 然后采用高速均質機，13 000 r/min條件下均質3 min，冰浴條件下攪拌30 min后，10 000 r/min，4 ℃離心15min，分別收集沉淀和上清液，上清液用100 mL容量瓶定容后采用Folin-酚蛋白定量試劑盒測定堿提取液吸光值，對照標準曲線(Y=0.001 4X+0.010 1)計算出蛋白質含量，確定最佳堿溶pH值。在最佳堿溶pH條件下提取蛋白溶液，然后分別加入1 mol/L HCl使最佳堿溶上清液的pH分別調至3.9、4.4、4.5、4.8、5.1、5.4、5.7和6.0保持30 min，然后以10 000 r/min, 4 ℃離心20 min。上清液采用100 mL容量瓶定容，然后采用Folin-酚蛋白定量試劑盒測定上清液吸光值，對照標準曲線計算出蛋白質含量，確定最佳酸沉pH值。最后收集沉淀調節pH至中性，冷凍干燥備用。

1.3.2 三種貝類分離蛋白的制備

根據上述3種貝類最佳堿溶酸沉pH進行SPI、CPI和API的制備，制備工藝流程如下：

貝肌肉→打漿→稱量→按1∶3(g∶mL)比例加入預冷超純水→1 mol/L NaOH調節至最佳堿溶pH值 →高速分散機勻漿3 min(冰浴)→4 ℃下攪拌30 min→10 000 r/min，4 ℃離心15 min→取上清液→ 1 mol/L HCl調節至最佳酸沉pH值→10 000 r/min，4 ℃離心20 min→取沉淀→冷凍干燥→密封保存備用。

1.3.2 分離蛋白基本組成分析

粗蛋白含量測定，凱氏定氮法GB/T5009.5—2003[17]；水分含量測定，直接干燥法 GB 5009.3—2010[18]；脂肪含量測定，索氏抽提法GB/T 5009.6—2003[19]；灰分含量測定，馬弗爐法GB 5009.4—2010[20]。

1.3.3 分離蛋白溶解性分析

參考ADEBIYI等[21]的方法測定蛋白質的溶解性。稱取3種貝類分離蛋白各10 mg分散在10 mL水溶液中，采用1 mol/L NaOH或HCl調節pH為2.0～12.0。室溫下磁力攪拌器攪拌20分鐘后，10 000×g離心10 min。 然后采用Folin-酚蛋白定量試劑盒測定堿提取液吸光值，對照標準曲線測定上清液中的蛋白質含量。

1.3.4 分離蛋白DSC分析

參考DA ROCHA等[22]方法并略加修改，將大約10～15 mg的凍干蛋白質樣品放置于樣品鋁盤中，以5 ℃/min的速率從20 ℃加熱至120 ℃測定樣品DSC曲線，使用密封的空盤作為參考。

1.3.5 分離蛋白氨基酸組成分析

稱取樣品數毫克，加入2 mL 5.7mol/L HCl，置于110 ℃烘箱內水解24 h，然后除去過量的HCl，加緩沖溶液稀釋到一定體積，搖勻。色氨酸的測定則采用5 mol/L NaOH進行堿水解。采用氨基酸自動分析儀分析，上機條件：流動相為專用緩沖液PI-1、2、3、4(分別為Ph 2.2、3.3、4.0、6.4檸檬酸鈉緩沖液)，流速0.225 mL/min，溫度25 ℃，上樣量50 μL[21]。

1.3.6 分離蛋白SDS-PAGE分析

采用SDS-PAGE電泳進行蛋白質組成成分測定；濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為12%，采用R-250考馬斯亮藍進行染色檢測[23]。

1.3.7 數據分析

實驗數據采用Microsoft Excel(Microsoft Corporation，USA)作圖，SPSS 22.0 (SPSS Inc.，USA) 進行方差(ANOVA)顯著性(p<0.05)分析。

2 結果與分析

2.1 最佳堿溶酸沉pH的確定

大多數蛋白質在中性和堿性pH下帶負電，通常等電點(pI)在pH 4～6。然而，不同來源的蛋白質可能存在一定差異性[24-27]。為了獲得3種貝類肌肉蛋白的最佳堿溶及酸沉pH值，分別在不同堿性pH (9～13)和酸性pH(3.6～5.7)條件下比較了堿性提取液的蛋白提取量和酸沉上清液的蛋白殘留量，見圖1，結果表明，隨著pH值的增加，3種貝肌肉堿提取液中的蛋白質含量呈上升趨勢，在pH 12和pH 13提取液中蛋白的含量達到最大值，并且這2種pH條件下，提取液蛋白含量沒有顯著性差異(p<0.05)，考慮到蛋白質變性及堿液的使用量，選擇pH 12為3種分離蛋白提取的最佳堿溶pH，進行下一步酸沉實驗。圖1結果顯示，扇貝和文蛤酸沉上清液中的最低蛋白質殘留率均處在pH 4.5～5.1，并且在pH 4.5、4.8和5.1之間沒有顯著性差異(p<0.05)。鮑魚酸沉上清液中的最低蛋白質殘留率在pH 4.8。因此，扇貝、文蛤和鮑魚酸沉淀的最適pH分別為5.1、5.1和4.8。

圖1 不同pH條件下3種貝類肌肉堿溶蛋白提取量及酸沉蛋白殘留率比較Fig.1 The comparison of protein extraction and residues from three shellfish muscles under different pH conditions注：圖中不同字母標注表示具有顯著性差異(p<0.05)。

2.2 SPI、CPI和API的基本組成分析

表1結果顯示3種貝類分離蛋白的基本組成分析，SPI的粗蛋白含量最高，達到(87.3±2.3)%(干基)，API達到(86.7±1.4)%(干基)，CPI達到(80.86±1.7)%(干基)；而CPI的總脂肪含量較高，達到(8.9±1.3)%(干基)，SPI和API的總脂肪含量較低，分別為(4.5±0.9)% (干基)和(4.8±0.8)%(干基)。3種分離蛋白的灰分含量分別為CPI (5.8±0.6)%(干基)，API (4.5±0.9)%(干基)和SPI (4.0±0.3)%(干基)。研究報道pH調節法提取蛋白可以顯著降低回收蛋白質中脂質的含量[28-29]。然而，表1結果顯示，3種貝類分離蛋白物中脂質的保留率相對較高。與魚類相比，貝類含有較高的磷脂[30]，與羅非魚分離蛋白相比較，貝類分離蛋白的脂肪保留率較高[31]。磷脂由于兩性特征具有乳化作用，與水和蛋白質產生相互作用。在蛋白提取過程中，由于蛋白質在接近其等電點的沉淀過程中重折疊，所以脂質可能在酸性pH沉淀期間被包埋在重折疊蛋白的內部。

表1 三種貝類分離蛋白基本組成分析(n=3)Table 1 Basic composition of the three shellfish proteinisolates (n=3)

注：*表中同一行數值不同字母標注表示具有顯著性差異(p<0.05)，**干基計。

2.3 SPI、CPI和API的溶解性分析

大多數蛋白質在等電點附近溶解性最差。蛋白質的溶解性對于其在食品工業中的應用是至關重要的。因此，圖2比較了pH 2.0～12.0條件下3種貝類分離蛋白的溶解性，3種貝類分離蛋白均顯示為拋物線形溶解曲線，在pH 4.0～5.5時溶解性最差，在酸性和堿性pH范圍內，pH 2.0和pH 12.0條件下，3種貝類分離蛋白分別達到最大蛋白質溶解度。比較這3種貝類分離蛋白的溶解性曲線，結果表明，CPI的溶解性最好。pH調節法提取蛋白過程中，隨著蛋白提取溶液的pH值下降或增加，蛋白凈電荷增加，增強了蛋白靜電排斥從而有利于蛋白質不發生折疊。采用此法回收的水產蛋白表現出表面疏水性和—SH基團的增加，從而使提取的分離蛋白溶解性下降。因此，pH調節法提取蛋白質過程中，蛋白質發生了pH誘導折疊現象[32]，有研究報道采用糖基化改性等方法可以改善扇貝分離蛋白的功能特性[33]。

圖2 pH 2.0～12.0 三種貝類分離蛋白溶解性比較分析Fig.2 The comparative analysis on solubility of the threeshellfish proteins isolates under pH 2.0-12.0

2.4 SPI、CPI和API的氨基酸組成分析

3種貝類分離蛋白的氨基酸組成分析結果見表2。

表2 三種貝類分離蛋白氨基酸組成分析 n=3 單位：g/100 g(蛋白)

*同一行中不同字母上標表示具有顯著性差異(p<0.05).**支鏈氨基酸：異亮氨酸+亮氨酸+纈氨酸

3種貝類分離蛋白均富含天冬酰胺和谷氨酸，并且必需氨基酸含量接近(分別為46.22%，45.62%和46.77%)，與相關魚類分離蛋白研究中報道的氨基酸組成含量差異不大[31]。根據FAO/WHO/UNU建議，3種貝類分離蛋白中所有必需氨基酸的含量符合成人和嬰兒的氨基酸要求。與推薦的FAO氨基酸模式相比，色氨酸為限制性氨基酸，其次是甲硫氨酸+半胱氨酸和組氨酸。支鏈氨基酸具有獨特的生理功能，可以消除或減少肝性腦病的癥狀，改善營養狀況和疲勞障礙[34]。CPI和API的支鏈氨基酸含量分別為19.33%和19.54%，SPI的支鏈氨基酸水平稍低，為18.76%。

2.5 SPI、CPI和API的DSC熱穩定性分析

DSC可用于表征大分子如蛋白質中的結構轉變特性。蛋白質的折疊涉及分子內作用鍵的破壞，主要是非共價鍵，蛋白質變性及結構發生變化在DSC曲線中表現出吸熱過程[35]。為了驗證加熱過程中3種貝類分離蛋白的高級結構變化，對3種貝類分離蛋白進行DSC分析。結果如圖3所示，3種分離蛋白的DSC曲線均顯示了1個主要的吸熱峰，表明在20～110℃發生了蛋白質變性。API、CPI和 SPI的主要吸熱峰分別集中在63、61和57 ℃。研究結果表明，SPI在DSC熱分析過程中比API和CPI更容易展開。SPI的較易變性與其蛋白質分子中較低的鍵能有關，這可能是由于pH調節過程中蛋白質中高級結構發生破壞引起的，而這種變性與蛋白質分子的解折疊或聚集的結構變化有關[36]。

圖3 三種貝類分離蛋白DSC分析曲線Fig.3 DSC analysis curves of the three shellfish protein isolates

2.6 SPI、CPI和API的SDS-PAGE分析

通過SDS-PAGE分析3種貝類分離蛋白蛋白質組成，同時比較了經過β-巰基乙醇還原處理與未經過β-巰基乙醇還原處理的樣品組成差異，結果見圖4，未經β-巰基乙醇處理樣品，3種貝類分離蛋白條帶主要集中在4個范圍(200,97,44和38 kDa)，而經β-巰基乙醇處理樣品，主要集中在200,97,44,38和18 kDa，其中97kDa和44 kDa條帶由于β-巰基乙醇處理，使蛋白質二硫鍵的減少而有所增加。大多數水溶性蛋白質在酸沉處理過程中被去除，因此，pH調節法所獲得的分離蛋白主要由肌原纖維蛋白組成。肌原纖維蛋白質由肌球蛋白重鏈(MHC)、輕鏈、肌動蛋白和α-輔肌動蛋白等組成。MHC和肌動蛋白分別出現在200 kDa和44 kDa。結果表明，3種貝類分離蛋白富含MHC、MLC和肌動蛋白。然而，魚肉和貝類肌肉蛋白組成之間存在明顯差異性，貝類肌肉含有形成粗絲的核心蛋白副肌球蛋白，并集中在97 kDa[37]。提取過程中NaOH和HCl溶液的濃度同時影響提取分離蛋白的形態，導致肌原纖維蛋白的降解，從而使MHC的含量下降[38]。相關研究顯示pH調節過程中，酸性或堿性pH條件下，分離蛋白對內源性蛋白酶高度敏感，貝類肌肉中富含蛋白酶，因此，圖譜中22 kDa、18 kDa和16 kDa等小分子蛋白條帶可能是蛋白提取過程中，由于蛋白酶降解所產生[39]。

圖4 三種貝類分離蛋白SDS-PAGE圖譜Fig.4 SDS-PAGE of the three shellfish protein isolates注：泳道1～3: SPI,CPI,API (β-巰基乙醇還原處理)，泳道4～6: SPI,CPI,API(無β-巰基乙醇還原處理)，M：蛋白分子量量標準

3 結論

pH調節法可有效提取水產動物肌肉中的營養蛋白質。上述研究結果表明采用此方法提取的3種貝類分離蛋白SPI、CPI和API的粗蛋白含量均高于80%(干基)，熱變性溫度分別在57.0、63.6和61.6 ℃；氨基酸分析結果表明：3種貝類分離蛋白是高質量氨基酸的良好來源，根據FAO/WHO/UNU建議，3種貝類分離蛋白必需氨基酸的含量符合成人和嬰兒的氨基酸需求，研究結果為貝類分離蛋白作為高品質營養蛋白基料應用于保健食品生產工業中提供理論基礎數據，并為進一步加工利用貝類資源開發貝類高附加值新型產品提供有效途徑。