酒曲中高產糖化酶霉菌的篩選及其固態發酵產酶條件優化

劉茗銘，周陽子，袁樂梅，劉新玉，邊名鴻

(四川理工學院，釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川 自貢，643000)

“曲為酒之骨”，小曲作為小曲白酒的糖化發酵劑，對于白酒的口感、風味起到至關重要的作用，是近年來研究的熱點[1-2]。在小曲微生物群落結構中，霉菌是微生物的主要菌群之一，在釀酒過程中主要起糖化作用。因其豐富的糖化型淀粉酶, 能將淀粉結構中的α-1,4鍵和α-1,6 鍵切斷，使淀粉絕大部分轉化為可發酵性糖，從而提高淀粉利用率[3-4]，因此糖化酶活力也是釀酒曲藥質量評定的主要指標。

近年來，有許多科研工作者嘗試直接使用糖化酶制劑作為糖化劑來提高小曲酒出酒率[5-6]，但此方法水解葡萄糖速度過快，極易導致生產過程中微生物生態環境失衡，釀造出的白酒存在口感辣沖、苦澀、不醇厚等缺點[7]。糖化酶主要來源于米曲霉、黑曲霉、根霉等絲狀真菌[8]。唐玉明[9]等通過傳統的分離手段對小曲樣中高產糖化酶的根霉進行了篩選，得到2株優良菌株，試飯糖分比Q303高出271%和218%，且大生產制曲效果好，出酒率和酒質均有提高。肖長清[10]等通過制麩曲的方法，對高產糖化酶產生菌Aspergillusniger進行了分離篩選，同時對產酶條件進行了研究。宋毅[11]通過物理誘變對黑曲霉菌株進行了誘變，得到了1株高產糖化酶菌株，產酶能力比出發菌株高31.7%。DONG[12]通過紫外線氯化鋰誘變糖化酵母As2.1548，成功獲得1株遺傳性能穩定的高產糖化酶菌種。

本研究從酒曲中篩選出1株高產糖化酶的霉菌，初步鑒定為米曲霉，并研究該菌株在不同溫度、pH值、酒精條件下的生長情況，再利用單因素和正交試驗優化其固態發酵工藝，從而確定該菌株的最佳產酶條件，為小曲酒生產過程中高糖化酶酶活菌株的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與培養基

菌種：前期從酒曲中篩選出的23株霉菌。

PDA固體培養基(g/L)：馬鈴薯(去皮)200，葡萄糖20，瓊脂20，pH值自然。

初篩培養基[13](g/L)：可溶性淀粉10，酵母膏1.5，NaNO31.5，K2HPO41，NaCl 0.5，MgSO40.5，FeSO40.01，瓊脂15，鏈霉素0.000 5，pH 7.0。

PDA液體培養基(g/L)：馬鈴薯(去皮)200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 值自然。

1.1.2 儀器與設備

全自動高壓滅菌鍋(MLS-3020)，日本三洋公司；恒溫恒濕培養箱(MJ-250)，上海齊欣科學儀器有限公司；數控恒溫搖床培養箱(BS-2F)，常州精成國華儀器有限公司；紫外可見分光光度計(UV-2000型)，上海尤尼柯有限公司；生物顯微成像系統(E100)，日本Nikon公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 檢測分析方法

孢子個數的測定方法：血球計數板計數法[14]；糖化酶活力測定方法：比色法[15]；試飯糖分：DNS法[16]。

1.2.2 高產糖化酶霉菌的篩選

初篩：用無菌接種針挑取少量各霉菌孢子分別點接在初篩培養基上，30 ℃恒溫培養72 h后，檢測透明圈直徑D，菌落直徑d，計算D/d值，選擇D/d值較大的作為復篩出發菌株。

復篩：將初篩后純種霉菌按文獻[17]中所報道的方法制成麩曲，通過測定麩曲的糖化酶活力，從而篩選出產糖化酶活力高的菌株，4 ℃下斜面保藏。

1.2.3 菌種鑒定

采用 SDS-酚氯仿抽提法提取霉菌微生物的 DNA[18]，此為模版， 采用引物 ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAAC-CTGCGG-3′) 和ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATAT-GC-3′)參照WHITE等[19]的方法擴增ITS區基因 ，并將擴增產物送北京擎科新業生物技術有限公司測序。將最終測序結果在NCBI中進行BLAST比對，并對近似序列進行系統發育學分析。

1.2.4 孢子菌懸液的制備

取1支保藏菌株的試管，用無菌水將菌株洗到150 mL含有玻璃珠的三角瓶中，在150 r/min的搖床上振蕩10 min后，稀釋至孢子含量為106個/mL備用。

1.2.5 霉菌耐受性研究

(1)霉菌對溫度的耐受性：將霉菌接種于PDA液體培養基中，分別置于23、26、29、32、35、38、41 ℃，搖床培養72 h，稱菌體干重。

(2)霉菌對pH值的耐受性：將霉菌接種于pH值分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5的PDA液體培養基中，搖床培養72 h，稱菌絲體干重。

(3)霉菌對酒精的耐受性：將霉菌接種于酒精體積分數分別為0%、4%、6%、8%、10%、12%、14%的液體培養基中，搖床培養72 h，稱菌絲體干重。

1.2.6 固態發酵產酶條件單因素研究

(1)培養溫度：稱取麩皮和糠殼共20 g(糠殼添加量為4%)，12 mL蒸餾水于250 mL的三角瓶中，混勻滅菌冷卻后，接入1 mL的孢子菌懸液，分別于26、28、30、32、34、36 ℃培養，72 h后進行酶活力測定。

(2)接種量：稱取麩皮和糠殼共20 g(糠殼添加量為4%)，添加12 mL蒸餾水于250 mL的三角瓶中，混勻滅菌冷卻，分別接入0.625%、1.25%、2.5%、5%、10%、20%孢子菌懸液，30 ℃恒溫培養72 h后進行酶活力測定。

(3)糠殼添加量：稱取麩皮和糠殼共20 g，其中糠殼添加量分別為0%、2%、4%、6%、8%、10%，加12 mL蒸餾水于250 mL的三角瓶中，混勻滅菌冷卻后，接入1 mL的孢子菌懸液，30 ℃培養72 h后進行酶活力測定。

(4)初始pH值：稱取麩皮和糠殼共20 g(糠殼添加量為4%)，12 mL蒸餾水于250 mL的三角瓶中，調節pH值分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，混勻滅菌冷卻后，接入1 mL的孢子菌懸液，30 ℃恒溫培養72 h后進行酶活力測定。

(5)料水比：稱取麩皮和糠殼共20 g(糠殼添加量為4%)，分別加入料水比為2∶1、20∶11、5∶3、20∶13、10∶7、4∶3 (g∶mL)的蒸餾水于250 mL三角瓶中，混勻滅菌冷卻后，接入1 mL的孢子菌懸液，30 ℃恒溫培養72 h后進行酶活力測定。

1.2.7 正交試驗

本試驗在單因素結果分析的基礎上，選取接種量(A)，溫度(B)，料水比(C)3個因子，每個因子設3個水平因素，正交試驗優化固態發酵產酶條件，因素水平設計表見表1。

表1 正交試驗因素水平設計表Table 1 Orthogonal test factor level design table

1.2.8 試飯糖分

試飯糖分含量定義：100 g米飯經過曲藥糖化后的含糖質量(g)。

蒸飯：取大米200 g，用水淘洗干凈，加水至總質量為420 g，進行蒸飯，上大汽后蒸40～50 min。要求飯粒熟而不爛，米飯含水量60%。

培菌糖化：稱取60 g米飯(稱取3個樣)涼至35 ℃，拌入米飯質量0.14%的曲霉曲樣品(即84 mg)，拌勻后裝入滅過菌的培養皿中，于30 ℃培養箱中培養46 h后取出，測定其試飯糖分含量。

1.3 數據分析

每組試驗重復3組，試驗結果以x±Se表示，用Excel對數據進行編輯作圖。

2 結果與討論

2.1 高糖化酶酶活霉菌篩選

2.1.1 初篩

將23株霉菌活化后接入選擇培養基，培養72 h后，檢測結果。霉菌菌落直徑(d)、透明圈直徑(D)以及比值(D/d)是表征霉菌糖化酶活力高低的指標。初篩部分透明圈圖片及菌株顯微形態見圖1；測量結果見表2。由表2可知，透明圈直徑D/d≥1.30的菌株共有3株，其中M21最大，D/d值達到1.71，選擇M5、M21、M22，D/d≥1.3的菌株作為復篩菌株。

圖1 初篩部分透明圈Fig.1 The initial screen is partially transparent注：自上到下分別是M5、M21、M22菌株的透明圈、菌落及顯微形態。

表2 高產糖化酶菌株初篩結果Table 2 The results of high yield glycosylase strain werefirst screened

霉菌編號菌落直徑(d)/mm透明圈直徑(D)/mmD/dM12.12.21.05M222.026.01.18M36.07.41.25M411.013.01.18M57.510.01.33M67.98.21.04M817.020.01.17M107.09.51.21M138.99.41.06M1621.022.01.05M2114.024.01.71M2212.020.01.67

注：共有23株菌株，編號為M1～M23，以上表格中未出現編號的菌株即為無透明圈。

2.1.2 復篩

將M5、M21、M22三株菌分別制成麩曲，測定麩曲的糖化酶活力，結果見表3。由表3可知，M5、M21、M22三株菌的糖化酶酶活均高于1 000 U/g，但M21 的糖化酶活力最高，為1 512.7 U/g。因此，選擇M21進一步研究其耐受性能和產酶特性。

表3 高產糖化酶菌株復篩結果 單位：U/g

2.1.3 菌種鑒定

采用MEGA軟件進行系統發育樹分析，結果見圖2。由圖2可知，菌株M21與3株Aspergillusoryzae(米曲霉)聚在一起，且相似度為100%。結合細胞形態學觀察，初步將該菌株歸屬于米曲霉。

圖2 高產糖化酶菌株的系統發育學分析Fig.2 Phylogenetic analysis of high yield glucoamylase strains

2.2 霉菌M21的耐受性能研究

2.2.1 溫度的耐受性

由于小曲酒糖化發酵時間短，在糖化發酵過程中升溫幅度較大，耐高溫的微生物更有利于小曲酒釀造。因此確定菌株對溫度的耐受能力很有必要。由表4可知，溫度的改變對霉菌M21的生長影響較小，菌株在26～35 ℃之間均能較好的生長；當溫度為38 ℃時，菌株生長受到一定抑制，高溫可導致細胞膜破壞、代謝活動減弱，而在41 ℃時霉菌還能生長，說明其耐溫性良好。

2.2.2 pH值的耐受性

小曲酒發酵周期短，產酸快，pH值較低[20]，因此對釀酒微生物耐酸性要求較高。同時pH值能改變微生物細胞中的電解質，從而對微生物的生長代謝造成一定影響。由表5可知隨著pH值的減小，霉菌的生長受到影響，pH 4以下生長受到明顯抑制，而在pH 4以上均能較好的生長，菌株M21的pH耐受性良好。

表4 不同溫度對霉菌M21生長的影響Table 4 The effect of different temperatures on the growth of mould M21

表5 不同pH值對霉菌M21生長的影響Table 5 The effect of different pH values on the growth of mould M21

2.2.3 酒精的耐受性

酒精是小曲中酵母菌厭氧發酵產物，酒精濃度的高低直接影響白酒發酵，霉菌和酵母本身在高濃度酒精環境中都受到一定的抑制作用，因此在小曲發酵的過程中，霉菌酒精的耐受能力對小曲的出酒率也有較大影響。由表6可以看出，霉菌隨著酒精濃度的升高，菌體存活率逐漸減低。隨著小曲酒發酵過程的進行，酒精體積分數逐漸升高，發酵后期能達到14%，霉菌M21在8%的酒精環境生長受到抑制，但在10%的酒精體積分數仍有一定的生長能力，高于其他常見霉菌[21]，因此該菌株耐酒精性能較好。

表6 不同酒精濃度對霉菌M21生長的影響Table 6 The effect of different alcohol concentration on the growth of mould M21

2.3 固態發酵產酶條件單因素研究

2.3.1 培養溫度對產糖化酶活力的影響

本試驗選擇26～36 ℃溫度區間，試驗結果如圖3。由圖3可知，霉菌糖化酶活力伴隨著溫度的上升呈現出先增加后降低的趨勢。霉菌的生長代謝受溫度的影響較大，同時溫度對酶的代謝也有很大的影響[22]。培養溫度較低微生物生長緩慢，產酶稀少；培養溫度過高會抑制甚至殺死微生物。當培養溫度為30 ℃產酶最多，因此選擇30 ℃為最佳培養溫度。

圖3 不同溫度對發酵產糖化酶活力的影響Fig.3 The effect of different temperature on the enzymeactivity of fermentation products

2.3.2 接種量對產糖化酶活力的影響

在固體發酵過程中，微生物的接種量對試驗結果有著較大的影響，接種量過大培養基營養不足，接種量過小菌體繁殖能力不夠，發酵動力不足。由圖4可知，隨著接種量的逐漸增大，糖化酶活力呈先增加后降低的趨勢，當接種量達到2.5%時，其糖化酶酶活達最大值1 698.3 U/g。繼續加大接種量，菌體變得密集，消耗培養基的速度加快，菌體所能利用的資源空間相對減少，不利于發酵產酶，因此2.5%為最佳接種量。

圖4 不同接種量對發酵產糖化酶活力的影響Fig.4 The effects of different inoculations on the enzymeactivity of fermentation products

2.3.3 糠殼添加量對產糖化酶活力的影響

在固體發酵過程中，糠殼添加量的多少決定了曲料的疏松程度，同時也影響著微生物的繁殖與產酶。由圖5可知，隨著糠殼的加入，發酵產物糖化酶活力先增大后減小。糠殼加量過少，曲餅過于緊實，氧氣含量不足，同時不利于發酵散熱；糠殼加量過大，曲料過于疏松造成麩皮曲不易形成餅狀，保水性減弱，曲料容易干，影響糖化霉菌的生長及酶的合成[23]。在糠殼添加量為4%時，曲料疏松度較好，氧氣含量高，利于微生物前期增殖和酶的合成[24]，此時糖化酶活力最大，為1 639.0 U/g。

圖5 不同糠殼添加量對發酵產糖化酶活力的影響Fig.5 The effect of the addition of different bran shells onthe enzyme activity of fermentation products

2.3.4 初始pH值對產糖化酶活力的影響

由圖6可知，隨著pH值的增大，糖化酶活力先增大后減小，在初始pH值為5.5時，糖化酶活力達到最大為1 605.4 U/g。

圖6 不同初始pH值對發酵產糖化酶活力的影響Fig.6 The effect of different initial pH on the enzymeactivity of fermentation products

2.3.5 料水比對產糖化酶活力的影響

合理料液比可以使培養基有較好的疏松性，增加空氣傳遞，使菌體代謝產生的酶更好地傳輸[20]。由圖7可知，糖化酶活力隨著水分的增加呈先增加后降低的趨勢。水分含量過低，培養基后期表面會逐漸干燥 ，不利于微生物生長繁殖及產酶[25]；水分含量過高又會導致曲料結合緊密，無法充分散熱，致使曲料溫度難以控制，影響菌株的生長和產酶。當料水比為20∶13 g/mL時，糖化酶活力達到最大值為1 621.7 U/g。

圖7 不同料水比對發酵產糖化酶活力的影響Fig.7 The effect of different water content on the enzymeactivity of fermentation products

2.4 正交試驗

通過正交試驗的結果如表7所示，所選中的3種處理條件對固態發酵產酶效果的影響由大到小依次為溫度>料水比 >接種量。通過比較3因素的水平均值，可以得出最佳處理條件為A1B2C1。以最佳處理條件進行驗證，此時糖化力為1 791.3 U/g，相應的最佳糖化酶產酶條件為溫度30 ℃、料水比5∶3 g/mL、接種量1.25%。

表7 正交試驗結果Table 7 Orthogonal test results

注：“k”表示糖化力平均值，“R”表示極差。

2.5 試飯糖分

將霉菌M21進行試飯試驗，46 h后測定其試飯糖分。一般的糖化霉菌試飯糖度在20 g/100 g左右[17,26]，而經過優化發酵條件后的霉菌M21試飯糖分達到24.76 g/100 g，表明該菌株糖化能力良好，有一定的應用價值。

3 結論

采用淀粉平板透明光圈法從實驗室保存的23株霉菌中初篩得到M5、M21、M22共3株糖化酶活力較高的霉菌菌株。通過制作純種麩曲測定其糖化酶活力，復篩得到1株高糖化酶酶活菌株M21，初步鑒定為米曲霉。該菌株能耐受體積分數10%的酒精，在pH 4以上能較好地生長，pH 3.5時生長受到明顯抑制，在23～41 ℃范圍內均能較好生長。該霉菌在培養溫度30 ℃、糠殼添加量4%、接種量1.25%、初始pH值為5.5、料水比5∶3 (g∶mL)條件下，培養72 h得到的固態發酵產物糖化酶活性可高達1 791.3 U/g。將該菌株制作成淺盤曲：外觀符合要求、試飯糖分含量24.76 g/100 g，預期采用此方法可增加出酒率。

由于本試驗主要對該菌株的產糖化酶條件進行了一定研究，并未研究該菌株蛋白酶酶活、發酵、生香等特性，所以對其綜合能力尚需進一步研究。