添加劑對羅非魚-海鱸魚混合魚糜的凝膠特性的影響

黃卉，何曉萌,2，李來好,3*，楊賢慶，郝淑賢，魏涯，吳燕燕

1(中國水產科學研究院 南海水產研究所，國家水產品加工技術研發中心，農業部水產品加工重點實驗室，廣東 廣州，510300)2(上海海洋大學 食品學院，上海，201306)3(廣東省漁業生態環境重點實驗室，廣東 廣州，510300)

魚糜制品的品質主要由其凝膠特性決定，一般來說凝膠特性好的魚糜其肌原纖維蛋白含量就高。海水魚肌原纖維蛋白含量較高，凝膠特性好于淡水魚，因此魚糜制品大多采用海水魚為原料，但其成本較高。隨著漁業資源的日益衰退，人們開始關注混合魚糜制品的經濟價值。已有研究[1-3]表明，混合魚糜制品的凝膠特性高于單一魚糜制品。羅非魚是中國南方最主要的淡水養殖品種之一，具有采肉率高，肉質鮮美，彈性良好的特點，隨著產量的不斷增長，逐漸成為全球關注的淡水養殖魚類[4-6]。但羅非魚加工產品形式單一，產品價值沒有得到充分開發。而將羅非魚與海水魚混合制備魚糜制品，可以降低成本，得到品質較好的產品，提高羅非魚的經濟價值。同時已有研究表明，不同添加劑對魚糜的凝膠特性具有增效作用[7-8]，還能改善制品的色香味。文章在羅非魚-海鱸魚混合魚糜的研究基礎上[9]，再通過添加劑的增效作用，開發凝膠特性較強、風味好、成本低的羅非魚混合魚糜制品。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅非魚(Oreochromisniloticus)、海鱸魚(Lateolabraxjaponicus)，購于2017年8月(鮮活)，葛根粉、馬鈴薯淀粉、木薯淀粉、大蒜粉、玉米胚芽油，購于廣州客村華潤萬家超市；海藻糖、山梨醇、面筋蛋白、大豆蛋白、卵清蛋白、牛血清蛋白、卡拉膠、魔芋粉、TGase酶，廣州市齊云生物技術有限公司；NaCl、明膠、KCl、NaH2PO4、單寧酸、Na2HPO4、檸檬酸鈉、葡萄糖酸鈣(溶于沸水)、CaCl2、焦磷酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉、Tris：分析純，廣州化學試劑廠；Triton X-100：分析純，廣州市博理生物科技有限公司；蛋白定量測試盒(考馬斯亮藍法)，南京建成生物工程研究所；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，康為世紀生物科技有限公司。

Ultra Turrax T50均質機，德國IKA公司；Sigma-3K30高速冷凍離心機，德國SIGMA公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋，常州澳華儀器有限公司；CT3質構儀，美國Brookfield公司；Powerpac @HV等電聚焦電泳儀，美國Bio-rad公司；Tanon1600凝膠成像系統，上海天能科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 魚糜加工工藝流程

魚肉預處理→混合(75%羅非魚+25%海鱸魚)→漂洗→脫水→擂潰→加入輔料→灌入腸衣→凝膠化(微波加熱)→冷卻至4 ℃冷藏過夜→測定樣品凝膠特性[9]

1.2.2 凝膠強度的測定

將樣品切成25 mm高的圓柱體，采用CT3型質構儀測凝膠強度。測定參數：壓縮模式測定魚糜凝膠的破斷強度(g)和凹陷深度(mm)，反映了魚糜凝膠的硬度和彈性[10]。選用直徑5 mm球形探頭壓縮樣品，測試速率1.0 mm/s、下壓位移15 mm、觸發值 5 g，每次試驗做3個平行，取平均值。凝膠強度(g·mm)=破斷強度(g)×凹陷深度(mm)

1.2.3 失水率的測定

將樣品切成5 mm的薄片并稱重(m1)，放于3張濾紙之上，然后用2張濾紙覆蓋，用5 kg的重物壓制并保持2 min，去掉濾紙，再次稱重(m2),按公式(1)計算失水率[11]：

(1)

1.2.4 肌原纖維蛋白的提取

取1 g樣品加6倍的A液(pH=7.5，0.1 mol/L KCl，20 mmol/L Tris-HCI緩沖液)和2倍的B液(1% Triton, pH=7.5，0.1 mol/L KCI，20 mmol/L Tris-HCI緩沖液)，用勻漿機勻漿(50Hz、100 s、3次)，過濾。再用冷凍離心機離心(4 ℃、6 000 r/min、10 min)，去除上清液，將沉淀用8倍的A液混合均勻離心，重復3次。最后用A液將沉淀洗出，即得到鹽溶性蛋白溶液[12]，用考馬斯亮藍法測定其濃度。

1.2.5 肌原纖維蛋白SDS-PAGE凝膠電泳

將樣品與5×的凝膠上樣緩沖液以4∶1的比例混合，煮沸5 min備用。電泳采用5%濃縮膠，10%分離膠，初始電壓80 V，當樣品進入分離膠后，將電壓增大至100 V，當溴酚藍到達分離膠底部上方約1 cm處，關閉電源，取出凝膠，用考馬斯亮藍R-250染色[13]，后脫色，在凝膠成像儀上成像。

1.2.6 數據處理

應用Excel及SPSS軟件對實驗結果進行統計分析，組間分析采用Tukey HSD法進行多重比較，p<0.05為顯著，p>0.05為不顯著，顯著性以a、b、c等字母表示。

2 結果與分析

2.1 淀粉糖類對混合魚糜凝膠強度和失水率的影響

根據文獻與預實驗結果分別添加葛根粉8%、馬鈴薯淀粉6%、木薯淀粉4%、海藻糖8%、山梨醇3%(均為質量分數)[14-16]制備羅非魚-海鱸魚混合魚糜。由圖1-A可知，只有添加山梨醇的混合魚糜的凝膠強度顯著高于對照組魚糜(p<0.05)，達到了2 748.99 g·mm，比對照組提高了6.34%。其他添加劑組魚糜的凝膠強度都顯著低于對照組魚糜(p<0.05)。添加劑組魚糜的失水率(圖1-B)都顯著低于對照組魚糜的7.68%(p<0.05)，尤其是葛根粉、海藻糖、山梨醇組的失水率降低最顯著，分別為1.71%、1.48%、1.67%。實驗得出，不同淀粉糖類對魚糜的凝膠強度和失水率存在顯著性影響。吳潤鋒等[16]研究發現，糖類輔料中，加入3%蔗糖和山梨醇后的魚糜凝膠強度最高，加入馬鈴薯淀粉、葛粉草魚魚糜的凝膠強度無顯著性差異；持水性強于對照組，這是因為不同輔料對水分的水合能力不同，造成了魚糜凝膠的水結合能力產生差異。因此，山梨醇可作為提高魚糜凝膠特性的輔料。

圖1 淀粉糖類對混合魚糜凝膠強度(A)和失水率(B)的影響Fig.1 Effect of starch sugar on the gel strength(A) andwater loss rate(B) of mixed surimi注：同一指標中小寫字母不同表示差異顯著(p<0.05)。下同。

2.2 蛋白類對混合魚糜凝膠強度和失水率的影響

根據文獻與預實驗結果分別添加面筋蛋白3%、大豆蛋白9%、卵清蛋白4%、明膠10%、牛血清蛋白3%[17-19]制備羅非魚-海鱸魚混合魚糜。如圖2-A所示，添加大豆蛋白、卵清蛋白、牛血清蛋白的混合魚糜的凝膠強度顯著高于對照組魚糜(p<0.05)，尤其是卵清蛋白和牛血清蛋白，分別達到了3 404.23 g·mm和3 843.64 g·mm，比對照組分別提高了31.69%和48.68%。其他添加劑組魚糜的凝膠強度又顯著低于對照組魚糜(p<0.05)。添加大豆蛋白、卵清蛋白、牛血清蛋白的混合魚糜的失水率(圖2-B)顯著低于對照組魚糜的7.68%(p<0.05)，失水率分別為1.2%、2.72%、2.71%。實驗得出，不同蛋白類對魚糜的凝膠強度和失水率存在顯著性影響。施珍珍等[19]研究表明，卵清蛋白的最適量為4%，凝膠強度為2 663.7 (g·mm)，比對照組增加了59.7%。因此，卵清蛋白和牛血清蛋白可作為提高魚糜凝膠特性的輔料。

圖2 蛋白類對混合魚糜凝膠強度(A)和失水率(B)的影響Fig.2 Effect of protein on the gel strength(A) and waterloss rate(B) of mixed surimi

2.3 天然提取物對混合魚糜凝膠強度和失水率的影響

根據文獻與預實驗結果分別添加卡拉膠0.8%、魔芋粉2%、大蒜粉1%、單寧酸1%、玉米胚芽油4%[7-8]制備羅非魚-海鱸魚混合魚糜。如圖3-A可得，添加單寧酸和卡拉膠的混合魚糜的凝膠強度顯著高于對照組魚糜(p<0.05)，分別達到了3 251.18 g·mm和3 485.11 g·mm，比對照組分別提高了25.77%和34.82%。其他添加劑組魚糜的凝膠強度變化不顯著。添加單寧酸、魔芋粉、卡拉膠的混合魚糜的失水率(圖3-B)顯著低于對照組魚糜的7.68%(p<0.05)，失水率分別為2.12%、2.33%、2.29%。實驗得出，不同天然提取物對魚糜的凝膠強度和失水率存在顯著性影響。鄧海萍等[20]通過實驗得出，添加卡拉膠能提高魚糜凝膠的硬度、膠黏性和咀嚼性，添加0.8%的卡拉膠使魚糜凝膠強度增加了22.37%。因此，單寧酸和卡拉膠可作為提高魚糜凝膠特性的輔料。

圖3 天然提取物對混合魚糜凝膠強度(A)和失水率(B)的影響Fig.3 Effect of natural extract on the gel strength(A) andwater loss rate(B) of mixed surimi

2.4 鹽類化合物對混合魚糜凝膠強度和失水率的影響

根據文獻與預實驗結果分別添加檸檬酸鈉0.2%、葡萄糖酸鈣0.05%、CaCl 0.3%、焦磷酸鈉0.2%、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)0.025%(均為質量分數)[21-22]制備羅非魚-海鱸魚混合魚糜。如圖4-A可得，添加檸檬酸鈉和葡萄糖酸鈣的混合魚糜的凝膠強度顯著高于對照組魚糜(p<0.05)，分別達到了3 167.15 g·mm和2 758.1 g·mm，比對照組分別提高了22.52%和6.69%。其他添加劑組魚糜的凝膠強度都顯著低于對照組魚糜(p<0.05)。只有添加檸檬酸鈉的混合魚糜的失水率(圖4-B)顯著低于對照組魚糜的7.68%(p<0.05)，失水率為1.58%。實驗得出，不同鹽類化合物對魚糜的凝膠強度和失水率存在顯著性影響。FILOMENA等[22]研究表明，檸檬酸鈉可提高羅非魚魚糜凝膠的硬度、黏性、彈性、內聚性及回復性。因此，檸檬酸鈉可作為提高魚糜凝膠特性的輔料。

圖4 鹽類化合物對混合魚糜凝膠強度(A)和失水率(B)的影響Fig.4 Effect of salt compound on the gel strength(A) andwater loss rate(B) of mixed surimi

2.5 與谷氨酰胺轉氨酶(TGase)結合實驗

通過實驗可知，添加山梨醇、卵清蛋白、牛血清蛋白、單寧酸、卡拉膠、檸檬酸鈉、葡萄糖酸鈣的羅非魚-海鱸魚混合魚糜的凝膠特性較高，然后分別加入0.025% TGase酶看混合魚糜的凝膠特性是否有顯著提升。通過實驗由圖5-A可得，添加劑組混合魚糜的凝膠強度相比于對照組都有顯著性提高(p<0.05)，尤其是牛血清蛋白、單寧酸、檸檬酸鈉組混合魚糜的凝膠強度分別達到了4 563.87、4 357.06、3 809.08 g·mm，比對照組分別提高了76.55%、68.55%、47.35%，極大的提高了羅非魚-海鱸魚混合魚糜的凝膠特性。失水率(圖5-B)除葡萄糖酸鈣組外，其余都顯著低于對照組魚糜的7.33%(p<0.05)。實驗得出，TGase酶與添加劑結合對魚糜的凝膠強度提高更加顯著。楊賢慶等[23]研究表明，當同時添加TGase酶和3%的牛血清蛋白時，鳶烏賊魚糜的凝膠強度最高。

圖5 TGase酶加添加劑對混合魚糜凝膠強度(A)和失水率(B)的影響Fig.5 Effect of TGase with additives on the gel strength(A) and water loss rate(B) of mixed surimi

2.6 SDS-PAGE凝膠電泳實驗

肌原纖維蛋白是決定魚糜制品凝膠特性的關鍵。肌原纖維蛋白主要包括肌球蛋白重鏈(MHC)、肌動蛋白(Actin)、原肌球蛋白(TM)等[24]。如下列電泳圖所示，SDS-PAGE結果顯示混合魚糜肌原纖維蛋白的MHC分子質量在200 kDa左右、Actin分子質量接近48 kDa、TM分子質量接近35 kDa。不同添加劑對羅非魚-海鱸魚混合魚糜肌原纖維蛋白的自溶有影響，其中對照組、山梨醇、葡萄糖酸鈣組魚糜中MHC和Actin降解較多，這是由于對照組魚糜中所含的內源性組織蛋白酶容易將MHC和Actin降解[25-26]，而添加劑對魚糜的內源性組織蛋白酶活性有抑制作用，且不同輔料的抑制效果也不相同。與對照組相比，添加卡拉膠、卵清蛋白、檸檬酸鈉、單寧酸、牛血清蛋白的混合魚糜肌原纖維蛋白的自溶明顯受到抑制作用，MHC、Actin和TM條帶明顯加深，而且添加TG酶組的條帶更寬，說明混合魚糜肌原纖維蛋白交聯程度更高，凝膠特性更好。此結論與上述結果一致，說明TG酶結合添加劑能夠顯著提高混合魚糜的凝膠特性。

M-標準品Marker；1-對照，2～8：山梨醇、葡萄糖酸鈣、卡拉膠、卵清蛋白、檸檬酸鈉、單寧酸、牛血清蛋白；9～16分別為1～8+TG酶圖6 添加劑和TG酶對混合魚糜凝膠電泳的影響Fig.6 Effect of additives and TGase on the gel electro-phoresis of mixed surimi

3 結論

通過在羅非魚-海鱸魚混合魚糜中添加淀粉糖類、蛋白類、天然提取物類、鹽類化合物，發現添加劑組混合魚糜的凝膠強度相比于對照組都有顯著性提高(p<0.05)，尤其是TGase酶與添加劑結合對混合魚糜的凝膠強度提高更加顯著。

TGase酶加牛血清蛋白、單寧酸、檸檬酸鈉組混合魚糜的凝膠強度分別達到了4 563.87、4 357.06、3 809.08 g·mm，比對照組分別提高了76.55%、68.55%、47.35%；失水率也顯著低于對照組魚糜的7.33%(p<0.05)，分別為1.4%、1.62%、1.36%；而且其電泳中MHC、Actin和TM條帶更寬，說明混合魚糜肌原纖維蛋白交聯程度更高，凝膠特性更好。