齊整小核菌發酵產硬葡聚糖的補料控制策略

高榮偉，周景文，徐國強,2*

1 (江南大學，工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122) 2 (江南大學，糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫，214122)

硬葡聚糖(scleroglucan)作為一種微生物多糖，以其良好的溶解性、假塑性、增稠性和穩定性廣泛應用于食品工業[1]、石油工業[2]和化妝品工業[3]。目前硬葡聚糖的合成主要是通過微生物發酵的方式[4]，微生物發酵具有易控制、產品便于提取[5]和精制、生產效率高等優點[6]，但也存在底物利用率偏低、收率低和生產成本過高等問題[7]，制約了硬葡聚糖在更廣泛行業的應用。由于硬葡聚糖和副產物草酸的具體合成途徑尚不明確，很難通過基因改造等手段來增加多糖產量，降低副產物合成，所以目前更多的研究在降低發酵生產成本和不斷改進硬葡聚糖生產工藝方面。KANG[8]等人通過改變通氣提高硬葡聚糖產量，在發酵前96 h將通氣量設定為0.75 vvm生產菌體，96 h后以0.4 vvm產多糖，發酵225 h硬葡聚糖產量達到最大值10.2 g/L，比0.4 vvm提高了30%。WANG[9]等人研究了發酵過程中的pH值調控策略，確定了發酵前96 h將pH值控制在3.5來增加生物量，96 h后將pH值控制在4.5來生產多糖的調控策略，發酵175 h硬葡聚糖達到15.0 g/L，比pH值控制在4.5提高了10%。WANG[10]等人研究了溫度對硬葡聚糖生產的影響，確定了硬葡聚糖生產的最適溫度為28 ℃，發酵196 h硬葡聚糖產量達到11.0 g/L，不過此溫度下草酸產量較高，達到3.6 g/L。FARINA[11]等人探究了硝酸鹽和銨鹽作為硬葡聚糖生產氮源對菌體生長和多糖生產的影響，以150 g/L蔗糖和硝酸鹽為碳氮源時，生物量和硬葡聚糖產量較高，硬葡聚糖產量達到26.0 g/L是以20 g/L蔗糖為碳源的4倍，底物利用率為17%。SURVASE[12]等人利用椰子水、甘蔗糖蜜和甘蔗汁等復合培養基進行深層發酵，其中甘蔗汁獲得最高多糖產量23.87 g/L，椰子水和甘蔗糖蜜分別獲得多糖12.58 g/L和18.45 g/L產量。目前關于硬葡聚糖的研究主要通過發酵原料(碳源、氮源、磷酸鹽等)和發酵條件(通氣、pH、溶氧、攪拌等)的改進來提高硬葡聚糖產量，獲得了較好的結果，但是也存在一些問題，像生產成本高、底物利用率低等。

以小核菌株(SclerotiumrolfsiiWSH-G01)為研究菌株，在3 L發酵罐水平上確定了最佳攪拌轉速的基礎上，研究不同補料方式對多糖產量的影響，確定了最適的補料方式為恒速流加補料，在此條件下能夠維持多糖生產所需要的較高的滲透壓條件，獲得較高生物量和硬葡聚糖產量，有效地提高了硬葡聚糖產量和生產強度，且底物利用率也進一步提高，降低了生產成本，為微生物發酵產硬葡聚糖的進一步放大培養提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

菌株：本實驗室保藏的小核菌株(SclerotiumrolfsiiWSH-G01)。

種子培養基[13](g/L)：葡萄糖30.0；KH2PO41.0；NaNO33.0；酵母浸粉1.0；KCl 0.5；MgSO40.25； pH 4.0。

發酵培養基(g/L):葡萄糖75.0；KH2PO41.0；NaNO33.0；酵母浸粉1.0；KCl 0.5；檸檬酸1.5；MgSO40.25 ； pH 4.0。

以上培養基115 ℃滅菌20 min。

1.2 實驗儀器

3 L發酵罐，上海保興生物有限公司；XWY-240恒溫搖床，上海智誠儀器有限公司；臺式高速離心機，德國eppendorf公司；高效液相色譜，美國Waters公司；恒溫水浴鍋，上海醫療器械研究所；高壓滅菌鍋，無錫醫療器械廠；葡萄糖/乳糖測定儀，深圳西爾曼科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養方法

搖瓶培養：將活化后的種子接種到裝液量為100 mL的500 mL搖瓶中，28℃下220 r/min培養48 h。

發酵罐培養：以5%的接種量將培養好的種子液轉接到3 L發酵罐中，裝液量1.5 L，攪拌轉速400 r/min，通氣量1 vvm，30 ℃下培養[14]。

1.3.2 分析方法

殘糖測定方法[15]：取發酵液1 mL，10 000 r/min離心5 min，取上清稀釋一定倍數，用葡萄糖/乳糖測定儀測定葡萄糖剩余量。

發酵液蛋白去除[16]：蛋白質在氯仿等有機溶劑中變性，將氯仿按多糖水溶液1/5體積加入，再加入氯仿體積1/5的正丁醇，劇烈振搖20 min，離心，分去水層和有機溶劑層交界處的變性蛋白，重復3次以上。

粗多糖的提取和生物量的測定參照文獻[17]，草酸檢測條件參照文獻[18]。

數據統計：生物量、殘糖和多糖產量的實驗數據每隔8 h取發酵罐發酵液進行測定，用Excel軟件計算3次平行實驗結果得到平均值和方差；pH值利用pH電極實時檢測，每8 h記錄1次。

2 結果與分析

2.1 3 L發酵罐條件下最佳攪拌轉速的確定

發酵過程中的溶氧情況是影響菌體生長與產物合成的重要因素，而改變溶氧狀態的一個重要方式就是改變攪拌速度，攪拌轉速的改變可以使罐體維持真菌產糖所需的溶氧量且適宜的攪拌轉速可以縮短發酵周期，但是高攪拌轉速產生的高剪切力也會影響菌體的生長。在生產硬葡聚糖的研究中發現氧限制會降低副產物草酸的產量，因為草酸合成酶在厭氧條件下被抑制，所以較低的氧氣供應有利于多糖的生產[19]。在前期分批發酵確定了最適葡萄糖濃度為75 g/L，最適通氣量為1 vvm的基礎上進行了攪拌速度優化，在3 L罐上采用不同攪拌速度(200、400、600 r/min)研究其對小核菌合成硬葡聚糖的影響。

發酵結果如圖1所示，在不同轉速下，菌體生長和硬葡聚糖合成表現出明顯的差異。

A-200 r/min; B-400 r/min; C-600 r/minΔ-pH;?-草酸; ○-殘糖; ■-硬葡聚糖; ●-干重圖1 攪拌轉速對發酵的影響Fig.1 The effect of stirring speed on fermentation

較低轉速更利于多糖的合成和菌體生長，而且副產物草酸的合成受到抑制。當攪拌轉速為600 r/min時，葡萄糖消耗、菌體生長和多糖合成明顯受到抑制。在轉速為600 r/min時發酵56 h硬葡聚糖達到最高值15.24 g/L，葡萄糖消耗量為38 g/L，細胞干重為9.96 g/L，由于高轉速引起的高剪切力抑制菌體的生長，導致多糖產量不高。攪拌轉速為200 r/min時，發酵64 h多糖產量達到最大值16.24 g/L，細胞干重為11.62 g/L，葡萄糖消耗量為40 g/L，過低的轉速導致發酵過程中氧氣不足，從而降低了產物合成速率，生產周期增加；相比之下，400 r/min時，葡萄糖消耗、菌體生長和多糖合成效果相對較好。發酵56 h葡萄糖消耗量為45 g/L，細胞干重為11.64 g/L，多糖產量為18.48 g/L，較200 r/min和600 r/min分別提高了14%和21%。生產強度為0.33 g/(L·h)，較200 r/min[0.25 g/(L·h)]和600 r/min[0.27 g/(L·h)]分別提高了32%和22%。底物利用率為24.6%，較200 r/min和600 r/min硬葡聚糖產量分別提高了13%和21%。攪拌速度越小罐體溶氧越低副產物草酸產量越小，200 r/min草酸最高產量為1.96 g/L，400 r/min草酸最高產量2.3 g/L，600 r/min草酸最高產量為3.6 g/L。前期研究中發現高硬葡聚糖水平存在于細胞合成替代能源的過程，硬葡聚糖合成的調控是在缺氧或壓力下激發的[21]，所以硬葡聚糖的合成不需要高溶氧條件并且副產物草酸在低氧條件下的合成受到抑制。但是過低的攪拌轉速條件下細胞溶氧嚴重不足，影響菌體生長。因此確定分批發酵的攪拌轉速為400 r/min。

2.2 一次性補料對發酵的影響

2.2.1 一次性補料時間對發酵的影響

前期研究發現真菌多糖的最高產量不是在對數后期就是在穩定增長階段[20]，所以補料時間的確定非常重要。從3 L發酵罐上硬葡聚糖分批發酵結果來看，發酵0～32 h是生長適應期，菌體干重增加緩慢，葡萄糖消耗量較小；發酵32～56 h是生長對數期，菌體干重增加較快，葡萄糖消耗較大；發酵56 h以后為生長穩定期，菌體干重增加變緩，葡萄糖消耗量較小。在發酵過程中32～56 h葡萄糖消耗速率最快，發酵至56 h消耗大約40 g/L，后期葡萄糖消耗減少，多糖由于β-1,3葡聚糖酶的作用下分解導致產量降低。為探究葡萄糖補料對多糖產量的影響，在初始葡萄糖濃度為75 g/L，通氣量為1 vvm，攪拌轉速為400 r/min條件下分別選擇發酵32、40、48 h時進行補料，一次性補入葡萄糖30 g/L。

結果如圖2 所示，隨著補料時間的推后，底物消耗、菌體生長和產物合成存在較大的差異。

A-32 h; B-40 h;C-48 hΔ-pH;?-草酸; ○-殘糖; ■-硬葡聚糖; ●-干重圖2 一次性補料中葡萄糖添加時間對發酵的影響Fig.2 The effect of glucose addition time on fermentation inOne-time Feeding

總體來看，硬葡聚糖產量呈現先上升后下降的趨勢，這是由于后期多糖水解酶的水解作用，將硬葡聚糖分解為小分子多糖[21]；細胞干重呈現一直增長的趨勢，先快速增長后緩慢增長。補料時間過早培養基中碳源濃度較高，利于草酸代謝途徑合成草酸[22]，草酸產量大幅度增加，嚴重影響了硬葡聚糖的合成。補料時間為32 h，發酵72 h硬葡聚糖達到最高產量23.02 g/L，葡萄糖消耗量為62 g/L，細胞干重為16.36 g/L，草酸產量達到3.38 g/L。過晚的加入葡萄糖錯過多糖合成的最佳時期，多糖產量較低且發酵周期延長，底物利用率降低。補料時間為48 h時，發酵80 h硬葡聚糖產量達到24.87 g/L，葡萄糖消耗量為65 g/L，細胞干重為17.0 g/L，草酸產量為2.8 g/L。相比較而言，在40 h一次性補料達到了較好的發酵效果，發酵72 h時硬葡聚糖產量達到最大值25.66 g/L，比32 h和48 h一次性補料分別提高了11%和9%；生物量達到19.32 g/L，比32 h和48 h一次性補料分別提高了18%和20%；生產強度為0.35 g/L/h，比32 h和48 h一次性補料分別提高了9%和6%，草酸產量為2.3 g/L均低于其他2種條件。前期分批實驗結果表明硬葡聚糖的大量合成在細胞生長對數后期約為40～56 h，過早的加入葡萄糖促進了草酸代謝途徑合成，不利于多糖的合成；在對數生長后期加入葡萄糖，錯過了菌體生長和產物合成的最佳時期，也不適合多糖的生產。因此確定一次性補料時間為40 h。

2.2.2 不同葡萄糖添加量對發酵的影響

硬葡聚糖的合成受環境滲透壓的影響，葡萄糖的添加能提高發酵環境滲透壓從而提高硬葡聚糖的產量，添加適量葡萄糖來控制合適的滲透壓環境對硬葡聚糖的生產具有重要的意義。依據上述實驗結果發酵40 h進行補料，探究一次性補料葡萄糖添加量對發酵的影響，分別向發酵罐中一次性補入20、30、40 g/L葡萄糖。

結果如圖3所示，多糖產量和菌體生長隨葡萄糖添加量的增加而增加，葡萄糖的大量添加為菌體營造了高壓環境，促使菌體為自我保護而消耗葡萄糖來合成多糖[22]。

A-20 g/L;B-30 g/L;C-40 g/LΔ-pH;?-草酸; ○-殘糖; ■-硬葡聚糖; ●-干重圖3 不同葡萄糖添加量對發酵的影響Fig.3 The effect of different glucose additions on fermentation

添加20 g/L時，發酵72 h硬葡聚糖產量達到23.87 g/L，葡萄糖消耗量為50 g/L，細胞干重為15.25 g/L，底物利用率25%；30 g/L時，72 h硬葡聚糖產量達到25.31 g/L，葡萄糖消耗量為52 g/L，細胞干重17.36 g/L，底物利用率24%；40 g/L發酵72 h硬葡聚糖產量達到26.31 g/L，葡萄糖消耗量為50 g/L，細胞干重18.52 g/L，底物利用率23%。40 g/L時多糖產量較20 g/L和30 g/L分別提高了6%和4%；生物量達到18.52 g/L，較20 g/L和30 g/L分別提高了21%和7%；生產強度為0.37，較20 g/L和30 g/L分別提高了12%和6%。30 g/L時草酸產量是最高的，達到2.14 g/L比20 g/L和40 g/L分別提高了19%和42%，說明草酸的產量隨葡萄糖的增加而增加當葡萄糖增大的一定濃度時草酸的產生反而被抑制，可以采用改變滲透壓降低副產物生成。底物利用率隨葡萄糖的添加而降低，40 g/L時最低。3種條件下底物消耗量相差不大，推測在高滲透壓環境下，硬葡聚糖合成效率更高。前期研究在以50或75 g/L蔗糖為碳源的培養基中添加NaCl或KCl來模擬150 g/L蔗糖為碳源的滲透壓條件，比僅以75 g/L蔗糖為碳源多糖產量提高了約50%[23]。因此后期研究中可以通過添加NaCl等來提高環境滲透壓從而降低生產成本。30 g/L產量并沒有40 g/L高，但是底物利用率偏高一些，生產成本也相對較低。因此添加量選擇30 g/L。從以上結果可知通過葡萄糖的添加，培養環境達到較高的滲透壓水平，多糖產量和細胞干重有所提升。但是大量葡萄糖的添加沒有被菌體很好地利用，底物利用率較低，需要探索其他的補料方式來以比較溫和的葡萄糖添加方式提高多糖產量。

2.3 恒速流加補料對發酵的影響

一次性補料優化對硬葡聚糖生產確實有效果，但是葡萄糖的大量添加使得菌體置于高濃度的葡萄糖中，需要一段時間的適應，硬葡聚糖產量并沒有很大的提升，反而底物利用率降低。為克服葡萄糖的大量添加造成的葡萄糖濃度過高對菌體生長的影響，采用恒速流加補料的方式來控制葡萄糖的添加量，以達到提高硬葡聚糖產量的效果。根據上述實驗結果確定了葡萄糖的補料開始時間為發酵40 h，持續補料時間32 h。以葡萄糖總濃度為(200、300、400 g/L)流加速度分別為[12、9、6 g/(L·h)]來研究恒速流加補料對多糖產量的影響。

結果如圖5所示，采用恒速流加方式細胞沒有出現不適應的現象，葡萄糖消耗和菌體生長迅速，在32 h硬葡聚糖就進入快速合成階段。葡萄糖總濃度越大，菌體生長、產物合成和葡萄糖消耗效果越好。葡萄糖總濃度為400 g/L時，發酵72 h時硬葡聚糖產量達到最大值32.62 g/L，較200 g/L和300 g/L分別提高了8%和5%；生物量達到22.36 g/L，較200 g/L和300 g/L分別提高了17%和4%；生產強度達到0.45 g/(L·h)，較200 g/L和300 g/L分別提高了7%和5%；底物利用率為28%，相比較于以150 g/L蔗糖生產硬葡聚糖的底物利用率17%[11]，提高了65%；副產物草酸隨葡萄糖總濃度的增加而增加，研究表明草酸形成的有利條件為較高的碳水化合物濃度和充足的氧氣的條件下[24]，而且副產物草酸和細胞干重呈正相關，都呈持續增長狀態[21]。實驗結果表明恒速流加補料能克服葡萄糖的大量添加對菌體生長的影響，葡萄糖消耗量大幅度增加，生物量提高明顯，硬葡聚糖產量有很大的提升。恒速流加補料在一定程度上提高了硬葡聚糖生產所需要的高滲透壓環境，刺激了多糖合成。

A-200 g/L;B-300 g/L;C-400 g/LΔ-pH;?-草酸; ○-殘糖; ■-硬葡聚糖; ●-干重圖4 不同恒速流加補料速度對發酵的影響Fig.4 Effects of different constant speed and feeding rateson fermentation

3 結論

為了提高齊整小核菌(SclerotiumrolfsiiWSH-G01)利用葡萄糖高效生產硬葡聚糖，在確定了最佳攪拌轉速的基礎上，研究了2種不同補料控制策略對硬葡聚糖產量的影響，確定了攪拌轉速400 r/min，發酵40 h開始補料，以葡萄糖總濃度為400 g/L，流加速度6 g/(L·h)持續補料32 h的補料策略，獲得硬葡聚糖產量32.62 g/L，比一次性補料提高了15%；生產強度0.45 g/(L·h)，提高了16%；底物利用率28.4%，高于一次性補料策略，較分批發酵提高了15.5%。硬葡聚糖的生產適宜在較低溶氧的環境條件下，因此采用較低攪拌轉速來維持環境中氧氣濃度。高滲透壓能刺激多糖合成并且抑制草酸代謝，相比較于一次性補料恒速流加補料產糖效果更好。既能維持較高濃度的滲透壓來促使菌體消耗葡萄糖產多糖，又能克服葡萄糖的一次性大量添加對菌體生長的抑制作用，底物利用率也有所提高達到28%，達到較好的發酵效果。但硬葡聚糖生產過程中還存在后期生成的β-1,3葡聚糖酶水解硬葡聚糖降低產量和底物利用率降低等問題，在以后的研究中將主要以這兩個方向為重點方向。