亞硒酸鈉對短乳桿菌CGMCC 6683細胞膜的影響

林官根，張紫薇，黨芳芳，滿朝新，姜毓君

(東北農業大學 食品學院，乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱，150030)

利用微生物將無機硒轉化為單質硒的研究已開展多年[1-4]，單質硒與無機硒相比較而言，具有低毒性以及高生物利用率等優點[5-6]，且這種生產單質硒的方式更加方便、高效和經濟，具有十分廣闊的應用前景。但是在微生物轉化無機硒為單質硒的過程中，菌體生長會受到抑制，這已成為生產諸如富硒酸奶等富硒發酵食品的瓶頸[7-8]。本研究通過表觀觀察以及基因水平的檢測，研究短乳桿菌(Lactobacillsbrevis)CGMCC 6683在代謝無機硒過程中的理化指標響應情況，并探討了該響應與菌體生物量下降之間的關系，發現菌體抵抗無機鹽脅迫時的關鍵基因。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

短乳桿菌(L.brevis)CGMCC 6683，由中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏。

1.1.2 培養基

MRS液體培養基，MRS固體培養基，青島高科園海博生物技術有限公司。

1.1.3 實驗試劑

Na2SeO3(分析純)，天津化學試劑研究所；細菌總RNA提取試劑盒(貨號：DP430)，反轉錄試劑盒(貨號：RR037A)，熒光定量PCR試劑盒(貨號：RR820A)，天津生化科技(北京)有限公司； LIVE/DEAD?BacLightTM細菌細胞活性測定試劑盒，西格瑪公司；丙二醛檢測試劑盒，碧云天試劑盒(貨號：S0131)。

1.1.4 基因選取與引物設計

選取6個與細菌抗氧化應激相關的基因用于后續實時熒光定量PCR研究，同時采用16S rRNA作為內參基因。所有引物由北京諾賽基因組研究中心有限公司合成，基因與引物信息見表1。

表1 引物信息Table 1 The information of the primers

1.2 儀器與設備

SU-8010場發射掃描電子顯微鏡，日本日立公司；TCS SP2 AOBS，德國Leica公司；MX3000P實時熒光定量PCR儀，美國安捷倫公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 生物量測定

將活化好的短乳桿菌以5%的接種量接種到25 mL含有不同濃度Na2SeO3(0、2、5、10、15、20 mmol/L)的MRS液體培養基中，37 ℃、150 r/min恒溫搖床培養24 h，取培養好的菌液1 mL，梯度稀釋后進行平板涂布(GB 4789.35—2016)[9]，待生長36～48 h后進行平板計數，以Na2SeO3濃度(mmol/L)為橫坐標，細菌生物量的對數值(lg CFU/mL)為縱坐標，繪制短乳桿菌的生物量柱狀圖。

1.3.2 場發射掃描電鏡觀察菌體

取用在含有不同濃度Na2SeO3(0、2、5、10、15、20 mmol/L)的MRS液體培養基中培養24 h后的短乳桿菌1 mL，加入體積分數為2.5%的戊二醛，并置于冰箱中(4 ℃)1.5 h以上，進行固定。然后對樣品進行沖洗、脫水和置換，置于冷凍干燥儀干燥4 h。將得到的樣品粘在掃描電鏡樣品臺上進行鍍膜，最后使用掃描電鏡觀察并拍攝電鏡照片，并對菌體表面元素進行元素分析。

1.3.3 細菌細胞活性測定

將培養好的短乳桿菌在8 000 r/min 下離心10 min，將菌泥重懸于2 mL生理鹽水中。將各6 μL的SYTO 9和PI染料加入到2 mL的離心管中得到混合染料工作液。各取100 μL菌懸液與工作液充分混合，在室溫下孵育15 min。用激光共聚焦顯微鏡對孵育好的樣品進行觀察，設置參數為激發波長485 nm，SYTO 9和PI的發射波長各自為542 nm和610 nm。

1.3.4 實時熒光定量PCR檢測

分別吸取在含有0和5 mmol/L Na2SeO3的MRS培養基中生長24 h后的短乳桿菌菌液各1 mL。離心得到菌泥后按照試劑盒說明書提取短乳桿菌總RNA，然后進行RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測菌體RNA的質量。合格后進行反轉錄得到菌體cDNA，調整濃度后進行實時熒光定量PCR檢測。

1.3.5 菌體內丙二醛變化測定

吸取在含有0和5 mmol/L Na2SeO3的MRS培養基中生長24 h后的短乳桿菌菌液各1 mL，在6 000 r/min下離心10 min收集菌泥，向得到的菌泥中加入1 mL細菌裂解液并在渦旋儀上充分混合裂解。分別取100 μL對照組和實驗組裂解后樣品于PCR管中，再分別向其中加入200 μL丙二醛檢測工作液，混勻后置于PCR儀中在100 ℃下加熱15 min。水浴冷卻至室溫，在1 000 r/min下離心10 min，取200 μL樣品于96孔酶標板中，調節酶標儀的激發波長為535 nm，發射波長為553 nm，進行熒光檢測，最終結果以實驗組相對對照組的熒光變化倍數表示。

1.3.6 數據處理與分析

以上實驗每組設置3個平行，結果值以平均值±標準差的形式表示，顯著性分析以p≤0.05為標準進行統計分析。所有數據和圖表均相應用SPSS 軟件(19.0版)和Origin軟件(8.0版)進行處理分析。

2 結果與分析

2.1 短乳桿菌生物量

據圖1可知，短乳桿菌在含有不同濃度Na2SeO3(0、2、5、10、15、20 mmol/L)的培養基中生長24 h后，其生物量發生銳減，數量級由108CFU/mL下降至104CFU/mL，說明隨著培養基中Na2SeO3濃度的升高，菌體生長受到該無機鹽的抑制也隨之增強。

圖1 短乳桿菌在含有不同濃度Na2SeO3培養基中生長24 h后的生物量Fig.1 The biomass of L.brevis growing in the mediacontaining different concentrations of Na2SeO3

2.2 場發射掃描電鏡圖像

將對照組與處理組的短乳桿菌置于掃描電子顯微鏡下進行觀察，根據圖2可知未經Na2SeO3處理的菌株菌體表面光滑平整，而經處理的菌株菌體表面出現圓形顆粒狀物質，初步推斷該顆粒為經短乳桿菌還原得到的單質硒。此外，處理組菌體表面同時伴有皺縮、塌陷甚至破裂的現象出現，而且這種現象會隨Na2SeO3濃度的增加而更加明顯。將場發射掃面電子顯微鏡與X-射線能譜儀聯用，分析處理組菌體表面顆粒物質的組成元素，在能譜圖上(圖3)1.5 keV處有吸收峰出現，該峰代表元素硒的存在[10]，而在對照組中未在此處出現吸收峰，因此可以判定上述圓形顆粒狀物質為單質硒。

A-對照組；B-2 mmol/L Na2SeO3；C-5 mmol/L Na2SeO3；D-10 mmol/LNa2SeO3；E-15 mmol/L Na2SeO3；F-20 mmol/L Na2SeO3圖2 短乳桿菌在未經Na2SeO3處理以及經不同濃度Na2SeO3處理后的場發射掃描電子顯微鏡圖像Fig.2 Scanning electron micrograghs images of L.brevisuntreated and treated with Na2SeO3

A-對照組；B-實驗組(5 mmol/L Na2SeO3添加量)圖3 X射線能譜分析儀分析短乳桿菌表面元素Fig.3 X-ray energy spectrometry analysis of L.brevis

2.3 細菌細胞完整性

檢驗細菌細胞在未經Na2SeO3處理以及經不同濃度Na2SeO3處理后菌體完整性。實驗用熒光染料SYTO 9是一種核酸結合染料，它可以標記所有待檢測菌體，熒光呈綠色；PI只可以標記細胞膜發生損傷的細胞，并且由于其與核酸親和能力強于SYTO 9，所以可以將SYTO 9替換掉，熒光呈紅色和(或)橘黃色[11]。由圖4可知，短乳桿菌未經Na2SeO3處理，24 h后，激光共聚焦顯微鏡下的熒光呈綠色，表明菌體表面完整未發生損傷；而經不同濃度Na2SeO3處理后的短乳桿菌，其鏡下熒光呈紅色和(或)橘黃色，并且這種現象隨著Na2SeO3濃度的增加而更加明顯，說明菌體細胞膜受到損傷。在20 mmol/L Na2SeO3實驗組中(圖4-F)，激光共聚焦顯微鏡下的可觀測菌體數量明顯少于其他組別，該現象與2.1部分生物量測定結果相一致，但是熒光呈現紅色的菌體數目幾乎為100%，進一步說明向培養基中添加高濃度Na2SeO3會使菌體細胞膜受損，從而導致生物量下降。

A-對照組；B-2 mmol/L Na2SeO3；C-5 mmol/L Na2SeO3；D-10 mmol/LNa2SeO3；E-15 mmol/L Na2SeO3；F-20 mmol/L Na2SeO3圖4 短乳桿菌在未經Na2SeO3處理以及經不同濃度Na2SeO3處理后的激光共聚焦圖像Fig.4 Laser scanning confocal microscope images of L.brevis untreated and treated with Na2SeO3

2.4 RNA瓊脂糖凝膠電泳圖

為檢驗所提菌株RNA的質量是否可以用于后續實時熒光定量PCR，利用瓊脂糖凝膠電泳方法對所提RNA進行電泳(圖5)，存在23S、16S和5S三條條帶，條帶清晰完整無雜帶，說明提取的RNA無明顯降解及污染，可用于后續實驗。

M-marker;1-對照組；2-實驗組圖5 試驗樣品瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.5 Agarose gel electrophoresis of experimental samples

2.5 實時熒光定量PCR檢測結果

本研究選取了6個與細菌抗氧化應激相關的基因，以此檢測短乳桿菌在含有Na2SeO3的培養基中生長過程中體內氧化應激狀態。根據圖6可知，有2個基因在處理組中發生顯著上調(p≤0.05)，分別是編碼甲硫氨酸(R型)亞砜還原酶的基因LVIS_0809(上調4.96倍)以及編碼硫氧還蛋白還原酶的基因LVIS_0645(上調3.25倍)。其余4個基因的表達量沒有發生顯著變化(p>0.05)，分別是2個編碼甲硫氨酸(S型)亞砜還原酶的基因LVIS_0810(上調1.62倍)和LVIS_0737(上調1.86倍)，編碼谷胱甘肽過氧化物酶的基因LVIS_2003(上調1.17倍)以及編碼過氧化氫酶的基因LVIS_0906(不變)。據FAHEY研究[12]，谷胱甘肽在革蘭氏陽性菌中的含量很少，所以編碼谷胱甘肽過氧化物酶的基因沒有發生顯著性變化，而甲硫氨酸亞砜還原酶以及硫氧還蛋白還原酶已被證實是生物體內抗氧化的主要物質[13]，因此編碼該2種蛋白的基因發生顯著上調，說明短乳桿菌經Na2SeO3處理后體內出現氧化應激狀態，出現的反應活性氧會致使膜發生脂質過氧化，從而導致菌體受損。

圖6 實時熒光定量PCR結果圖Fig.6 qRT-PCR resulted image注：*代表顯著差異(p≤0.05)

2.6 丙二醛變化測定結果

本實驗采用的試劑盒主要檢測原理：硫代巴比妥酸與丙二醛反應產生一種紅色物質，該產物在535 nm可以被激發產生553 nm最大發生波長，因此可以進行熒光檢測。由圖7可知，短乳桿菌在含有5 mmol/L Na2SeO3的培養基中生長，體內丙二醛含量較對照組有顯著性提高(p≤0.05)，其相對熒光值是對照組的2.47倍。說明短乳桿菌在降解Na2SeO3為單質硒的過程中，會發生氧化應激，產生的反應活性氧與膜上脂肪酸發生脂質過氧化反應，進而使菌體細胞膜受損，該結果與2.5部分的實時熒光定量PCR檢測結果互為印證。

圖7 丙二醛含量相對熒光變化圖Fig.6 The figure of relative fluorescence change of MDA注：*代表顯著差異(p≤0.05)

3 討論

短乳桿菌在含有無機鹽Na2SeO3的培養中生長24 h后，菌體表面附著一種呈光滑橢圓形狀的顆粒，其主要元素為硒元素，因此可知短乳桿菌可以將Na2SeO3轉化為零價態的單質硒。然而菌體在還原Na2SeO3為單質硒的過程中，其生長會受到抑制，生物量顯著下降。通過場發射電子掃描顯微鏡觀察，短乳桿菌在不添加Na2SeO3的培養基中生長時，菌體表面光滑完整，在含有Na2SeO3的培養基中生長時，會有表面皺縮、塌陷甚至破裂的菌體出現，這種現象會隨著所添加Na2SeO3濃度的增加而更加明顯。為進一步驗證其余表面沒有明顯破損的菌體是否完全沒有受到Na2SeO3添加的影響，本研究進一步利用2種核酸結合熒光染料進行檢測，通過激光共聚焦顯微鏡觀察，發現對照組中的菌體呈現綠色熒光，而在添加Na2SeO3的處理組中大部分菌體呈現橘黃色或者紅色熒光，說明Na2SeO3會使菌體膜發生破損。為探究造成這種膜損傷的原因，利用實時熒光定量PCR技術檢測了6個與細菌抗氧化應激相關的基因表達量情況，通過結果發現，在處理組中短乳桿菌體內編碼甲硫氨酸(R型)亞砜還原酶的基因以及編碼硫氧還蛋白還原酶的基因發生了顯著上調，說明Na2SeO3可以誘導菌體氧化應激的發生，在這一過程中產生的活性氧會攻擊菌體膜，使其發生脂質過氧化而造成菌體表面受損，從而進一步引起菌體死亡生物量下降，后續的丙二醛含量變化情況檢測結果也表明短乳桿菌在含有5 mmol/L Na2SeO3的培養基中生長后，其體內丙二醛的含量上升，與實時熒光定量PCR的結果互為印證，進一步說明菌體內脂質過氧化反應的發生。除此之外，單質硒的轉運以及滲透壓的變化而使菌體出現膜損傷的原因也不能完全排除。綜上所述，短乳桿菌CGMCC 6683在降解無機鹽Na2SeO3為單質硒的過程中，由于體內氧化應激產生的活性氧會使菌體膜受損，從而導致了菌體生物量的下降。今后應在膜保護劑方面做出進一步的研究，為工業化生產富硒食品提供可行性保障。

4 結論

短乳桿菌在不添加以及添加2 mmol/L Na2SeO3MRS培養基中生長24 h后菌體生長正常，而在添加5 mmol/L以及更高濃度Na2SeO3的培養基中生長，則會出現毒性效應。細胞膜的完整性和細胞表面形態都隨著Na2SeO3濃度的增加而朝著菌體膜受損的方向發展。同時在Na2SeO3的誘導下，菌體內部分與氧化應激相關的基因發生上調，丙二醛含量的增加與實時熒光定量PCR結果相互驗證，表明菌體細胞膜發生脂質過氧化反應。以上結果表明，短乳桿菌在降解Na2SeO3為納米硒的過程中，由于細胞膜受損導致其正常生理狀況會發生改變，同時伴隨著生物量的下降。