脾切除對原發(fā)性膽汁性肝硬化小鼠肝組織纖維化影響研究*

郭曉霞，郭琲婷，孔祥璐

原發(fā)性膽汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC）是一種病因未明的進行性非化膿性膽管炎性疾病，女性發(fā)病率較高，以肝內膽汁淤積為特征，常并發(fā)其他自身免疫性疾病，肝組織病理學表現(xiàn)為肝內膽管進行性破壞，伴匯管區(qū)炎癥和纖維化，發(fā)生門脈高壓癥，最終導致肝硬化[1]。門靜脈壓力越高，患者肝臟病變程度、肝功能減退程度和出現(xiàn)臨床并發(fā)癥的風險越大[2]。脾功能亢進癥是繼發(fā)于肝硬化門靜脈高壓癥的一種常見臨床表現(xiàn)，此類患者易發(fā)生胃食管靜脈曲張破裂出血而危及生命。因此，PBC患者伴脾功能亢進癥的臨床治療不容忽視[3]。脾切除術對門靜脈高壓的療效日益受到廣大學者的關注，有學者指出，在門靜脈高壓癥早期脾臟具有抗肝纖維化功能，而到進展期則無此作用。因此，在門脈高壓早期應當保留脾臟,而在進展期則應切除脾臟[4]。本研究以聚肌胞苷酸腹腔注射制備PBC小鼠模型，探討了脾切除術對PBC小鼠肝組織纖維化程度的影響。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器雌性 C57BL/6小鼠40只，5～6周齡，SPF級，體質量為18±2 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司【許可證號：SCXK（京）2014-0004】。飼養(yǎng)于山西省中醫(yī)藥研究院中心實驗室，室溫控制在22～25℃，保持濕度為40%～60%，12 h晝夜交替光照，給以充足的標準實驗飼料（北京科澳協(xié)力飼料有限公司，產(chǎn)品批號：15043311）和水飼養(yǎng)。依據(jù)山西省中醫(yī)院中心實驗室操作指南，所有受試動物均受到良好的待遇，本研究經(jīng)山西省中醫(yī)院動物倫理委員會審核通過。聚肌胞苷酸（太原博科生物有限公司，批號CAS24939-03-5），檢測小鼠腸組織 TNF-α 的ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司），兔抗TGF-β1多克隆抗體、RNA提取試劑盒（EasyPure RNA Kit，北京全式金生物技術有限公司，批號J20519），cDNA 逆 轉 錄 試 劑 盒（TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMi，北京全式金生物技術有限公司，批號J31212），熒光定量PCR試劑盒（QuantiFast SYBR Green PCR Kit，德國QIAGEN公司，批號151039406）。AU5821全自動生化分析儀（日本Olympus公司），Image-Pro Plus 6.0多功能圖象分析管理系統(tǒng)（美國Media Cybernetics公司），CX41正置顯微鏡（OLYMPUS公司），Auegrax-30k低溫臺式離心機（美國Beckman Coulter公司），Addcare ELISA 600酶聯(lián)免疫吸附檢測分析工作站（煙臺艾德康生物科技有限公司），F(xiàn)inesse325石蠟切片機（美國ThermoScientific公司），9902 Veriti定性PCR分析儀（美國 Applied Biosystems公司），T25 ULTRA-TURRAX組織勻漿機（德國IKA公司）。

1.2 PBC小鼠模型的制備 將40只雌性C57BL/6小鼠隨機分為正常對照組、模型組、脾切除組和假手術組，每組10只。參照文獻[5]給予模型組、脾切除組和假手術組動物1%聚肌胞苷酸（poly I:C）5 mg·kg-1腹腔注射，2次 /w，建立 PBC 模型，給予正常對照組等體積生理鹽水腹腔注射。在第20 w時，各組隨機抽樣行組織病理學檢查證實PBC形成。在制備PBC模型成功后，參照文獻方法[6]行脾切除術，給予脾切除組小鼠3.5%水合氯醛（0.01 ml·g-1）腹腔注射，腹部剃毛、消毒。沿腹中線自劍突下1 cm處行橫行切口，進入腹腔，游離脾臟，結扎脾動脈和脾靜脈，切除脾臟；假手術組小鼠行腹壁切開后，輕微翻動脾臟，不切除；正常對照組小鼠不行任何處理。繼續(xù)普通飼養(yǎng)喂養(yǎng)各組動物至32 w。

1.3 標本采集與處理 在20 w和32 w，各組隨機抽取5只小鼠送檢，禁食24 h，眼眶取血。稱體質量，處死動物，采集小鼠全部肝臟、末端回腸，用生理鹽水沖洗。將肝臟用濾紙吸干水分，稱量肝臟濕質量，計算各組小鼠肝臟指數(shù)[肝臟質量（mg）/體質量（g）]。將部分肝組織置入4%多聚甲醛溶液中固定，常規(guī)制片，HE和Masson染色，光鏡下觀察肝組織病理形態(tài)學變化。將剩余肝組織和末端回腸組織迅速置于-80℃冰箱中保存，以備組織蛋白和mRNA提取。

1.4 血生化指標檢測 將全血3000 r/m離心10 min，取上層血清，送至山西省中醫(yī)院檢驗科檢測。

1.5 肝組織 TGF-β1 mRNA水平檢測 采用RT-PCR 法，提取組織總 RNA，取 RNA 5 μg，行逆轉錄反應，合成cDNA，總反應體系為20μl。采用SYBR Green染料PCR法，反應體系為25 μl。應用 Primer Premier 5引物設計軟件設計篩選各基因特異性引物。所有引物均交由上海生工生物工程技術服務有限公司設計、合成。TGF-β1引物：上游5'-TGCTAATGG TGGACCGCAA-3'， 下 游 5'-CACTCTTCCCGAATGTCTGA-3'，擴增產(chǎn)物 100 bp；β-actin引物：上游5'-AGGCCAACCGTGAAAA-GATG-3'，下游 5'-ACCAGAGGCATACAGGGACAA-3'，擴增產(chǎn)物101 bp；TβRI引物：上游5'-ATGGTTCCGAG AGGCAGAGAT-3'， 下 游 5'-CCATGTCCCATTGTCTTTGTTG-3'， 擴 增 產(chǎn) 物 97 bp；TβRII引物：上游5'-CCAGAAGTCCTGCATGAGCAA-3'，下游 5'-TGGCAAACCGTCTCCAGAGT A-3'，擴增產(chǎn)物117 bp。擴增條件：95℃預變性5 min，95℃變性 10 s，60℃退火延伸 30 s，擴增設定為40個循環(huán)。在反應結束后，由電腦自動分析各樣本的Ct值，通過2－△△Ct計算mRNA相對水平，并由熔解曲線判斷PCR反應的特異性。

1.6 末端回腸TNF-α水平檢測 自-80℃冰箱取出回腸組織，恢復至室溫，稱量后用0.9%生理鹽水20倍稀釋，勻漿，所得混懸液經(jīng)5000 r/m離心15 min，取上清液,采用ELISA法檢測，在酶標儀450 mn波長下測定吸光度（OD值），用標準品繪制標準曲線，獲得樣品TNF-α水平。

1.7 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t或SNK檢驗，等級資料采用秩和檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠肝臟指數(shù)和肝功能指標變化比較 術前，各組小鼠肝臟指數(shù)之間差異無顯著統(tǒng)計學意義（P＞0.05），模型組、脾切除組和假手術組血清ALT和AST水平均顯著高于對照組（P＜0.05）；術后，模型組、脾切除組和假手術組肝臟指數(shù)均較正常對照組顯著下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），脾切除術組肝功能指標有所改善，顯著低于模型組（P＜0.05，表1）。

表1 各組小鼠臟器指數(shù)和肝功能指標（±s）比較

表1 各組小鼠臟器指數(shù)和肝功能指標（±s）比較

與對照組比，①P＜0.05；與模型組比，②P＜0.05

例數(shù) 肝臟指數(shù) ALT（U/L） AST（U/L） ALP（U/L）術前 對照組 5 34.6±4.6 33.5±5.6 146.3±31.1 131.0±26.8模型組 5 37.5±1.6 49.1±10.7① 167.5±25.0① 148.6±20.2①脾切除 5 37.2±5.0 47.3±17.1① 169.8±29.5① 146.4±29.8①假手術 5 37.4±53.9 48.6±12.5① 165.3±21.9① 150.1±23.6①術后 對照組 5 53.2±2.1 40.0±0.3 154.0±4.1 175.8±9.0模型組 5 39.1±1.0① 52.0±9.0 183.4±12.4 195.3±62.6脾切除 5 41.5±5.2① 43.5±6.4② 157.7±20.9② 178.1±38.0②假手術 5 39.6±7.5① 53.4±11.2 186.5±15.8 198.9±41.5

2.2 各組小鼠肝組織病理學變化 術前，正常對照組小鼠肝小葉結構清晰，無炎性細胞浸潤和膠原纖維沉積。模型組、脾切除組和假手術組小鼠肝組織內均可見肝小葉結構紊亂，匯管區(qū)周圍淋巴細胞浸潤明顯，有少量細小的膽管增生、畸形，匯管區(qū)周圍可見藍色膠原纖維環(huán)繞形成的纖維間隔（圖1、圖2）；術后，正常對照組肝小葉結構清晰，無明顯炎性細胞浸潤和膠原纖維沉積。模型組和假手術組肝小葉結構紊亂，匯管區(qū)及損傷的膽管周圍淋巴細胞浸潤，類上皮樣肉芽腫圍繞損傷膽管，界板出現(xiàn)碎屑樣壞死，匯管區(qū)周圍有大量的藍色膠原纖維環(huán)繞，形成明顯的纖維間隔。脾切除組小鼠肝組織匯管區(qū)周圍部分膽小管畸形、擴張，有少量的藍色膠原纖維沉積（圖3、圖 4）。

2.3 各組肝組織TGF-β1、TβRI和TβRII mRNA水平比較 術前，模型組、脾切除組和假手術組小鼠肝組織 TGF-β1、TβRI、TβRII mRNA 水平明顯升高，與對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。脾切除組、假手術組與模型組之間差異無明顯統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；術后，脾切除組小鼠肝組織TGF-β1、TβRI、TβRII mRNA 水平明顯降低，與模型組比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表2）。

圖1 各組小鼠肝組織病理學表現(xiàn) 術前（HE，100×）

圖2 各組小鼠肝組織病理學表現(xiàn) 術前（Masson，100×）

圖3 各組小鼠肝組織病理學表現(xiàn) 術后（HE，100×）

圖4 各組小鼠肝組織病理學表現(xiàn) 術后（Masson，100×）

表2 各組小鼠肝組織TGF-β1 、TβRI和TβRII m RNA水平（±s）比較

表2 各組小鼠肝組織TGF-β1 、TβRI和TβRII m RNA水平（±s）比較

與對照組比，①P＜0.05；與模型組比，②P＜0.05

例數(shù) TGF-β1 TβRI TβRII術前 對照組 5 0.4±0.03 0.4±0.15 0.3±0.01模型組 5 1.0±0.02① 1.0±0.07① 1.0±0.06①脾切除 5 1.0±0.09① 1.0±0.06① 1.0±0.11①假手術 5 0.9±0.05① 1.1±0.09① 0.9±0.05①術后 對照組 5 0.5±0.13 0.4±0.03 0.4±0.11模型組 5 1.0±0.10 1.0±0.08 1.0±0.09脾切除 5 0.5±0.09② 0.5±0.05② 0.5±0.09②假手術 5 1.0±0.11 1.1±0.08 0.9±0.07

2.4 PBC小鼠末端回腸TNF-α水平變化 術前，模型組、脾切除組和假手術組小鼠末端回腸TNF-α水平均明顯高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；術后，脾切除組小鼠回腸TNF-α水平明顯降低，與模型組比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表3）。

表3 各組小鼠末端回腸TNF-α水平（±s）比較

表3 各組小鼠末端回腸TNF-α水平（±s）比較

與正常組比，①P＜0.05；與模型組比，②P＜0.05

例數(shù) TNF-α（ng/L）術前 對照組 5 147.5±22.8模型組 5 237.9±33.6①脾切除 5 234.9±35.6①假手術 5 240.3±29.8①術后 對照組 5 58.9±30.6模型組 5 106.8±19.8脾切除 5 50.0±8.6②假手術 5 110.9±20.5

3 討論

PBC是以膽管上皮細胞損傷為特點的自身免疫性肝病，可發(fā)生于所有的種族和民族。文獻報道，本病年發(fā)病率為0.33/10萬～5.8/10萬，患病率為1.91/10萬～40.2/10萬，其中北美和北歐國家發(fā)病率較高[7]。近年來，我國文獻報道的PBC病例數(shù)呈快速上升趨勢[8]。PBC后期可發(fā)生肝硬化和門靜脈高壓的一系列并發(fā)癥，甚至在疾病早期就可出現(xiàn)門靜脈高壓癥[9]。新發(fā)門脈高壓是預后不良的征象，發(fā)生靜脈曲張后的1 a和3 a生存率分別為83%和59%[10]。門靜脈高壓癥的臨床表現(xiàn)為脾腫大、脾功能亢進癥和腹水等。治療門靜脈高壓癥的外科方法有脾切除、斷流術、分流術和肝移植手術等[11]。有學者指出，脾切除術可快速有效地緩解脾功能亢進癥，減緩肝硬化進程，降低肝癌發(fā)生率[12]。

本實驗結果顯示脾切除組、假手術組和模型組肝臟指數(shù)明顯增加，肝功能異常，肝組織病理學損傷明顯，提示肝硬化模型制備成功。在此基礎上行脾切除術，術后脾切除組肝臟體積明顯大于假手術組和模型組，肝功能及肝組織病理學損傷均較模型組有明顯的改善，與文獻報道結果一致[13]，提示腫大的脾臟對患者肝功能有損害作用，脾切除術可促進肝再生，改善肝功能，延緩肝纖維化發(fā)生。

TGF-β/Smads信號通路被認為在PBC發(fā)病過程中起關鍵作用[14]。研究表明肝硬化時脾臟合成TGF-β1和TNF-α增加，可能是引起肝臟纖維組織過度增生的關鍵所在[15]。TNFα和TGF-β等能觸發(fā)或參與了肝臟炎癥反應[16]。有學者發(fā)現(xiàn)脾切除可降低血清 TGF-β1水平而改善肝功能，延緩肝纖維化發(fā)展[17]。本研究結果發(fā)現(xiàn)術前脾切除組和模型組肝組織 TGF-β1、TβRI、TβRII mRNA水平明顯高于正常對照組，術后脾切除組肝組織TGF-β1、TβRI、TβRII mRNA 水平有所下降，提示脾切除可下調TGF-β1表達，從而抑制PBC進展。

臨床上，高達80%肝硬化患者存在不同程度的胃腸道癥狀，門靜脈高壓性腸病發(fā)病率約為25%～70%[18]，腸道分泌TNF-α和IL-6等增加，進一步破壞腸道免疫功能，是影響患者生活質量和預后的重要原因[19，20]。本研究發(fā)現(xiàn)術前脾切除組和模型組小鼠末端回腸TNF-α水平均明顯高于正常對照組，提示TNF-α在肝臟疾病的進展中發(fā)揮了重要作用。脾切除術后回腸TNF-α有所下降，或許能減輕腸道免疫損傷。