玉龍貼膏質量標準研究

劉東文，何寶凝 ，陳韻姿，陳淑映，李懷國

（廣東省佛山市中醫院制劑中心，廣東 佛山 528000）

溫經玉龍散是佛山市中醫院骨科的臨床驗方，由赤芍、肉桂、生草烏、白芷、干姜等組方，能溫經散寒、活血止痛，主要用于跌打舊患、寒邪著絡引起的關節酸痛或外科關節痛等癥，臨床已使用近50年，療效確切[1－3]。但由于使用時要加水、蜜糖等煮成糊狀再敷于患處，并用繃帶固定，導致使用不便，且使關節活動受限。為滿足臨床用藥需要，本研究中擬以溫經玉龍散為配方，以熱熔壓敏膠為基質研制出新的貼膏劑玉龍貼膏。熱熔壓敏膠是繼溶劑型和乳液型壓敏膠之后的第3代壓敏膠產品，以熱塑性聚合物為主體成分，兼有熱熔和壓敏雙重特性，為近年經皮給藥系統研究的熱點[4]。方中生草烏所含烏頭堿既是有效成分，又是毒性成分，因此嚴格控制其含量十分必要。本研究中對方中主要藥味進行了定性、定量研究，可為質量標準的制訂和臨床安全用藥提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 1525型高效液相色譜儀，2996型紫外檢測器（美國Waters公司）；CPA225D型十萬分之一電子天平（賽多利斯公司）；KQ－300DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DT5－1型低速臺式離心機（北京時代北利離心機有限公司）。

1.2 試藥

玉龍貼膏（醫院自制制劑，批號分別為3081603，3081604，3081605，規格為每片 9 cm）；芍藥苷對照品（批號為 110736－201438），桂皮醛對照品（批號為110710－201217），烏頭堿對照品（批號為 110720－201111），均由中國食品藥品檢定研究院提供。預制硅膠G薄層板（德國默克公司）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 制備方法

取赤芍、肉桂、生草烏、白芷、干姜等藥材，粉碎成細粉，過篩，混勻，加入融化成液態的熱熔壓敏膠和適量輔料，攪拌均勻，涂布，冷卻，切片，制成1 000片，即得，每片含赤芍、生草烏的生藥量均為0.84 g，含肉桂生藥量為0.42 g。

2.2 薄層色譜鑒別

2.2.1 赤芍

取本品2片，除去蓋襯，剪成小塊，加乙醇80 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取芍藥苷對照品，加乙醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作為對照品溶液。按處方比例及制法，以淀粉代替赤芍制成不含赤芍的陰性樣品，取2片，按供試品溶液制備方法制成缺赤芍的陰性對照品溶液。照2015年版《中國藥典（四部）》通則中薄層色譜法試驗，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－乙酸乙酯－甲醇－甲酸（40 ∶5 ∶10 ∶0.2）為展開劑[5]158，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，且陰性對照無干擾。結果見圖1 A。

2.2.2 肉桂

取本品1片，除去蓋襯，剪成小塊，加乙醇10 mL，冷浸30 min，時時振搖，濾過，取濾液作為供試品溶液。另取桂皮醛對照品，加乙醇制成每1 mL含1 μL的溶液，作為對照品溶液。按處方比例及制法，以淀粉代替肉桂制成不含肉桂的陰性樣品，取1片，按供試品溶液制備方法制成缺肉桂的陰性對照品溶液。照2015年版《中國藥典（四部）》通則中薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液和缺肉桂的陰性對照品溶液各5 μL，對照品溶液2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）－乙酸乙酯（17 ∶3）為展開劑[5]137，展開，取出，晾干，噴以二硝基苯肼乙醇試液。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，且陰性對照無干擾。結果見圖1 B。

2.3 芍藥苷含量測定

2.3.1 色譜條件

色譜柱：XTerra RP18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 －0.05 mol／L 磷酸二氫鉀溶液（38 ∶62）；檢測波長：230 nm；流速：1.0 mL ／min；進樣量：10 μL。理論板數以芍藥苷峰計應不低于3 000。

2.3.2 溶液制備

圖1 薄層色譜圖

取同一批（批號為3081603）樣品10片，除去蓋襯，精密稱定，剪碎，混勻，取相當于1片的質量，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入50%乙醇50 mL，稱定質量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質量，用50%乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，再用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，作為供試品溶液。取經五氧化二磷減壓干燥器中干燥36 h的芍藥苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成含芍藥苷0.515 0 g／L的溶液，作為對照品溶液。按處方比例取除赤芍外的其余成分制成缺赤芍的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。

2.3.3 方法學考察

系統適用性試驗：精密吸取2.3.2項下3種溶液各10 μL，按擬訂色譜條件測定，記錄色譜圖，詳見圖2。結果在與對照品溶液相應位置上，供試品溶液有色譜峰，陰性對照品溶液無色譜峰，表明陰性對照無干擾。

線性關系考察：精密吸取芍藥苷對照品溶液1，2，5，10，15，20 μL，按擬訂色譜條件測定，以峰面積（Y）對芍藥苷進樣量（X）進行回歸，得線性方程 Y＝1.55×106X＋2.38×105，r＝0.999 2（n＝6）。結果表明，芍藥苷進樣量在0.515～10.300 μg范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取同一對照品溶液，重復進樣6次，測定。結果芍藥苷峰面積的 RSD為0.46%（n＝6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取同一批（批號為3081603）樣品6份，按2.3.2項下方法制備供試品溶液，測定含量。結果芍藥苷平均含量為每片0.027 7 g，RSD為0.57%（n＝6），表明方法重復性良好。

圖2 芍藥苷高效液相色譜圖

穩定性試驗：取同一供試品溶液，分別于 0，4，8，12，18，24 h時進樣，依法測定，記錄峰面積。結果的RSD為1.02%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內穩定。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為3081603）6份，分別精密加入芍藥苷對照品，依法制備供試品溶液，進樣測定，計算回收率。結果見表1。

表1 芍藥苷加樣回收試驗結果（n＝6）

2.3.4 樣品含量測定

取3批樣品，依法制備供試品溶液，進樣測定。結果批號為3081603，3081604，3081605的樣品中每片平均含量分別為 0.027 7，0.027 5，0.026 4 g，RSD 分別為0.57%，0.61%，0.51% （n＝3）。

2.4 烏頭堿限量檢查

2.4.1 色譜條件

色譜柱：XTerra RP18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 －0.1%三乙胺（70 ∶30）；檢測波長：235 nm；流速：1.0 mL ／min；進樣量：10 μL。理論板數以烏頭堿峰計應不低于3 000。

2.4.2 溶液制備

取同一批（批號為3081603）號的樣品10片，除去蓋襯，精密稱定，剪碎，混勻，取相當于1片的質量，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加濃氨水20 mL，靜置5 min，再加乙醚 50 mL，冷浸 24 h，轉移至離心管中，在 3 000 r／min的轉速離心 5 min，取乙醚層，沉淀用乙醚洗滌5次，每次20 mL，合并乙醚液，低溫（＜40℃）揮干，殘渣精密加甲醇5 mL溶解，密塞，搖勻，再用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液作為供試品溶液。取烏頭堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成含烏頭堿0.301 2 g／L的溶液，作為對照品溶液。按處方比例取除生草烏外的其余成分制成缺生草烏的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。

2.4.3 方法學考察

系統適用性試驗：精密吸取2.4.2項下3種溶液各10 μL，按擬訂色譜條件測定，記錄色譜圖，詳見圖3。結果在與對照品溶液色譜相應位置上，供試品溶液有色譜峰，陰性對照品溶液無色譜峰，表明陰性對照無干擾。

圖3 烏頭堿高效液相色譜圖

線性關系考察：精密吸取烏頭堿對照品原液1.0，2.0，3.0，5.0 mL，分別置 10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，連同烏頭堿對照品原液按擬訂色譜條件進行測定，以峰面積（Y）對烏頭堿質量濃度（X）進行回歸，得線性方程 Y＝ 4.61×104X－5.53×105，r＝0.999 0（n＝4）。結果表明，烏頭堿進樣量在0.301 2～3.012 0 μg范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取質量濃度為0.301 2 g／L的烏頭堿對照品溶液，重復進樣6次，測定。結果烏頭堿峰面積的 RSD為0.87%（n＝6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取同一批（批號為3081603）樣品6份，按2.4.2項下方法制備供試品溶液，測定含量。結果烏頭堿平均含量為每片 0.451 8 mg，RSD為 1.27% （n＝6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液，因烏頭堿溶液不穩定，故存放于冰箱中，分別于 0，2，4，8，12 h 時各進樣 10 μL，記錄峰面積。結果的 RSD為0.93%（n＝5），表明供試品溶液在12 h內穩定。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為3081603）6份，分別精密加入烏頭堿對照品，依法制備供試品溶液，進樣測定，計算回收率。結果見表2。

表2 烏頭堿加樣回收試驗結果（n＝6）

2.4.4 樣品含量測定

取3批樣品，依法制備供試品溶液，進樣測定。結果批號為3081603，3081604，3081605的樣品中，烏頭堿每片平均含量分別為 0.451 8，0.445 7，0.455 2 mg，RSD 分別為 1.27%，1.14%，1.36% （n＝3）。

3 討論

玉龍貼膏為新型的中藥橡膠膏劑，具有組成復雜、主藥含量少和基質難于去除的特點。基質與待測成分分離是橡膠膏劑含量測定的關鍵，在制訂質量標準時要考慮所選成分的代表性及測定方法的可行性。赤芍是方中主藥，其主要有效成分為芍藥苷，因此選擇芍藥苷的含量作為一個質控指標。比較了芍藥苷多個提取方法[無水乙醇回流提取、50%乙醇回流提取[6]、甲醇回流提取[7]和甲醇回流提取后過柱[8]]，比較了提取時間 20，40，60 min，結果發現50%乙醇回流提取60 min提取率最高。因此，采用該方法作為本品芍藥苷的含量測定方法。根據2015年版《中國藥典（一部）》赤芍飲片項下規定含芍藥苷不得少于1.5%，按理論計算本品每片含芍藥苷應不得少于0.012 6 g。本研究中對玉龍貼膏3批次的樣品進行芍藥苷的含量測定，結果均符合規定。

草烏為國家規定的28種有毒中藥材之一，為保證制劑產品質量和臨床安全用藥，必須嚴格控制其使用量，而《中國藥典》并未對生草烏外用作出限量規定。參考原衛生部藥典委員會《中華人民共和國衛生部藥品標準·中藥成方制劑》標準，含草烏的外用制劑只有一個制劑品種，即烏頭酊，烏頭堿的限量規定為0.045%～0.055% （g ／mL）[9]。因此，玉龍貼膏含烏頭堿應為每片0.378～0.462 mg。本研究中對玉龍貼膏3批次的樣品進行烏頭堿的限量檢查，結果均符合規定。

烏頭堿的提取方法有多種，氨乙醚冷浸、氨乙醚超聲提取、酸提氯仿萃取、酸提乙醚萃取[10]等，經比較后選取提取效率較高的氨乙醚冷浸法。在流動相比例選擇上，曾采用甲醇 －0.2%三乙胺（66∶34）、甲醇－0.2%三乙胺（60∶40），但分離效果不理想，最后選用甲醇－0.1%三乙胺（70∶30）為流動相，分離效果好。采用高效液相色譜法測定烏頭堿的含量，準確，可靠，較薄層色譜法能更準確地反映藥品的毒性水平，可更好地指導生產，為臨床安全用藥提供依據。