活血巴布劑質量標準研究

龐 鵬，陳寅生 ，趙 穎

（江蘇省南京市中醫院，江蘇 南京 210001）

活血散是我院臨床老中醫根據祖傳方劑提煉、精簡而成的醫院制劑，臨床應用時間長，且安全、有效。但其使用過程中存在缺陷：含有動物藥土鱉蟲，放置時間長容易變質；臨用時需要加飴糖調敷，容易掉藥和污染衣物，臨床使用不方便；因調制藥粉量不準確，容易造成散劑使用劑量不準，影響療效；順應性差，散劑藥粉太粗，外敷有沙粒感，患者自覺不舒適，對皮膚有刺激性。以上諸多缺點嚴重限制了活血散的使用，有必要尋求一種有效、便捷的現代劑型替代傳統劑型?；钛筒紕┦怯缮╅_發的新劑型，由地膚子、黃柏、天南星、地鱉蟲等藥味組方，具有活血化瘀、消腫止痛的功效，用于骨折、骨裂及軟組織挫傷等跌打損傷諸癥。本研究中采用薄層鑒別和含量測定方法來控制活血巴布劑的質量，從而建立其質量標準?，F報道如下。

1 儀器與材料

1290型超高效液相色譜儀，紫外檢測器（安捷倫公司）?；⒄溶諏φ掌罚ㄖ袊称匪幤窓z定研究院，批號為111575－200502）；地膚子、天南星、黃柏、地鱉蟲對照藥材均購于安徽亳州永剛飲片廠有限公司，經南京市中醫院李文主任中藥師鑒定，均符合藥典要求；活血巴布劑為醫院自制制劑，飲片均購于安徽亳州永剛飲片廠有限公司，經南京市中醫院李文主任中藥師鑒定，符合藥典要求；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

地膚子[1－2]：取活血巴布劑 1 片，加甲醇 50 mL，超聲處理30 min，濾液蒸干，定容至10 mL容量瓶，作為供試品溶液。按上述方法制備地膚子對照藥材溶液。取缺地膚子的活血巴布劑1片，按上述方法制備陰性對照品溶液。吸取供試品溶液、對照藥材溶液、陰性對照品溶液適量，點于同一硅膠G薄層板上，展開劑為二氯甲烷 － 甲醇 － 水（10 ∶4 ∶1.2），展開，取出，晾干，顯色劑為10%硫酸乙醇溶液。供試品溶液色譜中，斑點顯色清晰，陰性對照無干擾。色譜圖見圖1 A。

天南星[3－4]：取活血巴布劑 1 片，加乙醇 30 mL，冷浸24 h，濾過，濾液水浴濃縮至干，加甲醇1 mL溶解，作為供試品溶液。取天南星對照藥材2 g，按上述方法制備對照藥材溶液。取缺天南星的活血巴布劑1片，按上述方法制備陰性對照品溶液。吸取供試品溶液、對照藥材溶液、陰性對照品溶液適量，點于同一硅膠G薄層板上，展開劑為二氯甲烷∶甲醇（9∶1），顯色劑為10%磷鉬酸乙醇溶液。供試品溶液色譜中，斑點顯色清晰，陰性對照無干擾。色譜圖見圖1 B。

黃柏[5－6]：取活血巴布劑1片，加1% 醋酸甲醇溶液40 mL，于60℃超聲處理20 min，濾過，濾液濃縮至2 mL，作為供試品溶液。取黃柏對照藥材0.1 g，加1%醋酸甲醇20 mL，按上述方法制備對照藥材溶液。取缺黃柏的活血巴布劑1片，按上述方法制備陰性對照品溶液。吸取供試品溶液、對照藥材溶液、陰性對照品溶液各 5 μL，點于同一硅膠G薄層板上，展開劑為三氯甲烷 －甲醇 －水（30∶15∶4）的下層溶液，置氨蒸氣飽和的展缸內，展開。置紫外光燈（365 nm）下，供試品溶液色譜中，顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾。色譜圖見圖1 C。噴以改良碘化鉍鉀試液，供試品溶液色譜中，斑點顯色清晰，陰性對照無干擾。色譜圖見圖1 D。

地鱉蟲[7－8]：取活血巴布劑 1 片，加甲醇 50 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇5 mL使溶解，作為供試品溶液。取土鱉蟲對照藥材1 g，按上述方法制備對照藥材溶液。取缺土鱉蟲的活血巴布劑1片，按上述方法制備陰性對照品溶液。照《中國藥典》薄層色譜法進行試驗，吸取上述溶液各10 μL，點于同一硅膠 G薄層板上，展開劑為甲苯－二氯甲烷－丙酮（5∶5∶0.5），置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，斑點顯色清晰，陰性對照有干擾。色譜圖見圖1 E。

圖1 薄層色譜圖

2.2 虎杖苷含量測定[9－10]

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（2）柱 （250 mm × 4.6 mm，5 μm），柱號 225 －1125；流動相：乙腈 － 水（23 ∶77）；檢測波長：306 nm。理論板數（按《中國藥典（一部）》虎杖藥材項下）虎杖苷峰計應不低于3 000。

2.2.2 溶液制備

取虎杖苷對照品，置五氧化二磷的干燥器內減壓干燥24 h后，取出適量，精密稱定，加稀乙醇制成15 μg／mL的溶液，得對照品溶液。取貼劑的1／10，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL，稱量，記錄，超聲30 min（功率為500 W）后取出，再稱量，用稀乙醇補足減失的質量，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。取缺虎杖貼劑的1／10，置具塞錐形瓶中，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗：取缺虎杖的陰性對照品溶液，搖勻，注入液相色譜儀，按擬訂色譜條件進樣10 μL。結果表明，在虎杖苷色譜峰處無干擾，詳見圖2。

圖2 專屬性試驗高效液相色譜圖

標準曲線繪制：分別精密吸取質量濃度為15 μg／mL的對照品溶液 2，5，10，15，20 μL 進樣，以峰面積均值（Y）為縱坐標、進樣量（X）為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程 Y＝2.93 X＋3.24，r＝0.999 9（n＝5）。結果表明，虎杖苷進樣量在30～300 μg范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取質量濃度為15 μg／mL的對照品溶液，按擬訂色譜條件連續進樣6次。結果峰面積平均值為453.6，RSD為0.27%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液，于10 h內每隔2 h進樣 10 μL。結果峰面積平均值為 2 057，RSD為2.62%（n＝6），表明供試品溶液在10 h內穩定性良好。

重復性試驗：取貼劑的1／4，加入稀乙醇25 mL，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測定含量。結果含量平均值為 5.66 mg／g，RSD 為 2.93%（n＝5），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密取相當于原藥材0.04 g的貼劑，平行6份，加入質量濃度為0.21 g／L的對照品溶液1.0 mL，依法制備供試品溶液，測定。結果見表1。

表1 虎杖苷加樣回收試驗結果（n＝6）

2.2.4 樣品含量測定

取貼劑的1／4，依法制備供試品溶液并測定。結果3 批樣品（批號分別為 150227，150316，150413）虎杖苷含量分別為 10.72，10.82，10.82 mg，平均 10.79 mg， RSD為0.49%（n＝3）。最終確定成品中虎杖苷的含量應不少于每貼5 mg。

3 討論

3.1 檢測指標選擇

2015年版《中國藥典（一部）》虎杖藥材項下含量測定的檢測成分分別為大黃素和虎杖苷，大黃素的藥理功效為抗腫瘤活性、抗微生物生長、免疫抑制、解痙止咳、降壓、利尿、瀉下等[11－12]，虎杖苷的藥理功效為鎮咳、調血脂、降低膽固醇、抗休克等[13－14]?；⒄溶盏膶傩詮姡渌幉纳儆泻行С煞只⒄溶眨瑫r虎杖苷樣品處理簡單，處理過程中可減少有效成分的損失，重復性強，故檢測指標選用虎杖苷。

3.2 展開劑選擇

活血巴布劑中地膚子、天南星、黃柏、地鱉蟲的薄層鑒別斑點均顯色清晰。其中地膚子中采用藥典法時發現展開劑極性較大，通過調整溶劑及比例，最終確定以二氯甲烷－甲醇 －水（10∶4∶1.2）的下層溶液為展開劑時，重復性好，斑點顯色清晰。2015年版《中國藥典（一部）》中天南星處理方法比較煩瑣，處理過程中會增加人為誤差，但樣品純凈度較高。

3.3 流動相選擇

色譜柱選擇十八烷基硅烷鍵合硅膠作為填充劑，流動相的比例略有變化，選擇3個比例分別為乙腈－水（22 ∶78），乙腈 － 水（23 ∶77）及乙腈 － 水（24 ∶76）?？紤]到圖譜中色譜峰的峰形及分離度，確定流動相乙腈－水（23 ∶77）為最佳。

3.4 不足

由于活血巴布劑方中天南星既為有效藥味，又為有毒成分[15]，天南星的有毒成分是由其植物中所含有的特殊生物代謝產物草酸鈣針晶、草酸鈣針晶表面糖蛋白和微量的多糖組成。粉體粒徑降低，可破壞天南星科中的草酸鈣針晶，降低毒性，但是否會影響活血巴布劑的療效有待于進一步研究。下一步將對天南星與地鱉蟲中有毒成分毒蛋白作進一步研究，并通過相應的藥理和毒理試驗，以驗證活血巴布劑的有效性和毒性。