白藜蘆醇對哮喘小鼠肺功能氣道炎癥的影響

姜寧 張峰 郭魯閩 張秀榮

支氣管哮喘是由多種炎性細(xì)胞及細(xì)胞組分引發(fā)的慢性氣道炎癥性疾病，容易引起氣道上皮細(xì)胞的壞死脫落、纖毛受損，同時平滑肌細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、黏膜下腺體增生會引起氣道基底膜的增厚及氣道黏液分泌過多等病理表現(xiàn)。目前認(rèn)為哮喘的主要發(fā)病機(jī)制是TH1/TH2炎癥細(xì)胞因子比例失衡導(dǎo)致的[1]，使TH2細(xì)胞數(shù)目的相對增多和功能的亢進(jìn)優(yōu)勢應(yīng)答。內(nèi)外源性過敏源誘發(fā)機(jī)體過敏反應(yīng)，激活CD4+TH2細(xì)胞，而CD4+TH2細(xì)胞為主的T細(xì)胞受刺激之后活性增強(qiáng)，進(jìn)而釋放白細(xì)胞介素-4(interleukin-4, IL-4)、IL-5為主的TH2型炎癥因子[2]。并且反過來會抑制CD4+TH1細(xì)胞釋放干擾素-γ(interferon-γ, IFN-γ)等細(xì)胞因子，導(dǎo)致TH1/TH2細(xì)胞比例失衡。目前糖皮質(zhì)激素雖然是治療哮喘急性發(fā)作最有效的藥物，但也存在諸多不良反應(yīng)。中醫(yī)中藥對調(diào)節(jié)TH1/TH2失衡狀態(tài)有一定作用，可緩解哮喘癥狀。白藜蘆醇(resveratrol)是一種多酚類化合物，在自然界中普遍存在，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗癌、抗脂質(zhì)過氧化及抗氧化應(yīng)激等多種藥理活性[3-5]。為探究白藜蘆醇對哮喘小鼠肺功能及氣道炎癥的影響，本研究以卵蛋白致敏小鼠誘導(dǎo)哮喘模型，通過檢測各組小鼠肺功能及炎性細(xì)胞因子的變化，探究白藜蘆醇對哮喘小鼠肺功能及氣道炎癥的治療作用。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

90只SD級6周齡Balb/c雌性小鼠(購自山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物飼養(yǎng)中心)，體質(zhì)量12～20 g，按隨機(jī)雙盲分為對照組、哮喘組及白藜蘆醇組3組，每組為30只。哮喘組和白藜蘆醇組予卵蛋白(ovalbumin, OVA)致敏及誘導(dǎo)哮喘，對照組以生理鹽水代替；白藜蘆醇組在最后1周霧化前1 h給予白藜蘆醇5 mg/kg腹腔注射。哮喘模型制備參照HONDA方法制作[6]。OVA由Sigma公司提供；ELISA試劑盒(購于武漢華美生物科技公司提供)； TRIzol總RNA提取試劑、SuperQuickRT cDNA第一鏈合成試劑盒(For Real-time PCR)、UltraSYBR Mixture(with ROX)購自于康為世紀(jì)公司，980超聲霧化儀器(由新天緣設(shè)備公司生產(chǎn) 上海)；基因擴(kuò)增儀；實(shí)時定量PCR儀。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 肺功能檢測： 水合氯醛麻醉小鼠，氣管切開，套管針置入、固定，將小鼠放入密閉的箱子中，按指標(biāo)連接管道。機(jī)械通氣參數(shù)：呼吸頻率為90次/min，潮氣量5.6 ml/kg。呼吸壓力為-8 cmH2O (1 cm=0.098 kPa)，記錄跨肺壓、流速，潮氣量容積的變化，用計算機(jī)計算用力最大流速(peak expiratory flow, PEF)、FEV0.4/FVC時用5倍潮氣量進(jìn)行機(jī)械通氣，-8 cmH2O負(fù)壓輔助呼氣，氣道反應(yīng)性以肺阻力(resistance of lung, RL)表示。

3. 組織處理： 處死小鼠后取出肺組織于10%中性甲醛中固定，經(jīng)脫水、包埋制成蠟塊并制作病理切片，HE染色觀察。

4. 白細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞總數(shù)計數(shù)： 取小鼠內(nèi)眥靜脈血，收集于含有肝素鈉的EP管中，用PBS稀釋后涂片，進(jìn)行白細(xì)胞及嗜酸性細(xì)胞計數(shù)。

5. 細(xì)胞炎性因子： 處死小鼠后小鼠氣管中注入0.3%的生理鹽水0.5 ml行支氣管肺泡灌，共3次，并收集肺泡灌洗液，以離心半徑8 cm 1 000 r/min離心10 min，收集上清保存待測。ELISA法檢測氣道炎癥因子的濃度 。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、各組小鼠肺組織病理學(xué)改變

對照組氣道黏膜正常，肺泡壁結(jié)構(gòu)完整，無黏液分泌及炎癥細(xì)胞的浸潤；哮喘組小鼠氣道黏膜充血水腫，肺泡壁結(jié)構(gòu)殘缺，有大量黏液分泌，支氣管壁及血管周圍有大量炎癥細(xì)胞浸潤；白藜蘆醇組小鼠黏膜水腫、肺泡壁殘缺、黏液分泌及炎癥細(xì)胞浸潤程度均比哮喘組輕，見圖1。

二、肺功能變化

哮喘組小鼠肺功能指標(biāo)PEF(7.26±0.23)、FEV0.4/FVC(1.42±0.09)均高于對照組小鼠PEF(12.42±0.28)、FEV0.4/FV(2.25±0.12)(P<0.05);白藜蘆醇組指標(biāo)PEF(9.54±0.26)、FEV0.4/FVC(1.92±0.11)則明顯低于哮喘組指標(biāo)PEF(7.26±0.23)、FEV0.4/FVC(1.42±0.09)(P<0.05)。哮喘組氣道反應(yīng)性RL(2.12±0.10)高于對照組氣道反應(yīng)性RL(1.64±0.09)，白藜蘆醇組哮氣道反應(yīng)性RL(1.18±0.09)低于哮喘組RL(2.12±0.10)，見圖2。

三、血清中白細(xì)胞計數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)及百分比

哮喘組血清中白細(xì)胞(59.87±27.76)、嗜酸性粒細(xì)胞總數(shù)(28.24±10.82)、嗜酸性粒細(xì)胞百分比(5.04±2.84)均明顯高于對照組血清中白細(xì)胞(26.83±2.14)、嗜酸性粒細(xì)胞總數(shù)(1.57±0.98)、嗜酸性粒細(xì)胞百分比(4.78±1.65)(P<0.05);白藜蘆醇組血清中白細(xì)胞(35.16±17.23)、嗜酸性粒細(xì)胞總數(shù)(28.24±15.54)、嗜酸性粒細(xì)胞百分比(4.82±1.76)則明顯低于哮喘組(P<0.05) ，見表1。

表1 白細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)

四、BALF中IL-4、IL-5及IFN-γ的表達(dá)含量

哮喘組肺泡灌洗液中IL-4(65.28±3.76)及IL-5(87.98±4.83)在蛋白水平表達(dá)均明顯高于對照組IL-4(39.62±2.84)及IL-5(62.74±3.96)在蛋白水平的表達(dá)(P<0.05)；白藜蘆醇組IL-4(47.19±3.13)及IL-5(72.16±3.42)在蛋白水平的表達(dá)則明顯低于哮喘組(P<0.05)，哮喘組肺泡灌洗液中IFN-γ(74.26±10.82)在蛋白水平表達(dá)明顯低于對照組(88.76±8.03)(P<0.05)，白藜蘆醇組肺泡灌洗液中IFN-γ(82.15±9.32)在蛋白水平表達(dá)高于哮喘組(P<0.05)，見圖3。

討 論

支氣管哮喘是由多種炎性細(xì)胞及炎性細(xì)胞因子參與并引起的以氣道炎癥、氣道重塑等病理生理改變?yōu)橹鞯穆匝装Y性疾病。而氣道炎癥在哮喘中發(fā)揮了主導(dǎo)作用[7-8]。一般認(rèn)為TH1/TH2平衡狀態(tài)的失衡可導(dǎo)致TH2細(xì)胞因子分泌增多[9]，而TH1細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄因子 T-bet 的作用下分化成熟，介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答并且能夠增強(qiáng)炎癥細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，進(jìn)而引起氣道黏膜損傷及炎癥反應(yīng)激活[10]。TH2細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄因子 GATA3 的作用下分化成熟，主要介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答并且能夠促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞在氣道內(nèi)浸潤，進(jìn)而增加 IgE 的分泌并增加氣道反應(yīng)性[11]。抗原性異物感染生物體，免疫細(xì)胞通過識別、攝取等一系列免疫應(yīng)答機(jī)制激活TH2細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞合成并釋放大量以IL-4、IL-13等TH2型細(xì)胞因子，這些細(xì)胞介質(zhì)分泌到胞外介導(dǎo)Ⅱ型免疫應(yīng)答[12]。另一方面，這些細(xì)胞因子能活化血管內(nèi)皮黏附因子[13]，使中心粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞趨化到組織病變部位，活化的中性粒細(xì)胞釋放蛋白酶溶解周圍組織，作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致血管通透性升高，促使大量的炎癥細(xì)胞從血管內(nèi)進(jìn)入組織液、病變組織中[14]，并合成及分泌大量、充足的Ⅱ型細(xì)胞因子，使發(fā)病機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能失衡，誘發(fā)及加重支氣管哮喘。支氣管哮喘持續(xù)反復(fù)的發(fā)作，會加重氣道氣管結(jié)構(gòu)的改變[15]，引起氣道狹窄、氣流受限，嚴(yán)重著肺功能會出現(xiàn)通氣性和彌散性功能障礙，引起PEF、FEV1/FVC降低、氣道反應(yīng)性增高等表現(xiàn)。TNF-α、IFN-γ、IL-2 是 TH1合成和分泌的細(xì)胞因子，具有促炎因子的活性，能夠促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞的激活并增強(qiáng)多種炎癥細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用[16]。

白藜蘆醇(resveratrol, Res)是一種天然小分子化合物，稱為非黃酮類多酚化合物[17-18]，多項(xiàng)研究 發(fā)現(xiàn)其對炎癥、腫瘤等多種疾病中具有良好的治療作用，這可能與其具有抗氧化、抗炎、抑制腫瘤活性以及改善細(xì)胞內(nèi)能量代謝等作用有關(guān)。Birrell等[19]證明白藜蘆醇在脂多糖誘導(dǎo)的小鼠肺損傷中具有抗炎的作用。李玉屏[20]研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可減輕COPD患者組織細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡。而支氣管哮喘本身也是多種炎性細(xì)胞及細(xì)胞組分參與的慢性炎癥，基于白藜蘆醇的抗炎、抗氧化等作用，本實(shí)驗(yàn)提出了是否其對支氣管哮喘也具有一定的抗炎及改善氣道重塑作用的假說。

本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組小鼠氣道黏膜正常，肺泡壁結(jié)構(gòu)完整，無黏液分泌及炎癥細(xì)胞的浸潤；哮喘組小鼠氣道黏膜充血水腫，肺泡壁結(jié)構(gòu)殘缺，有大量黏液分泌，支氣管壁及血管周圍有大量炎癥細(xì)胞浸潤。氣道炎癥的存在加重氣道的高反應(yīng)性和氣道重塑，導(dǎo)致氣道痙攣及狹窄，進(jìn)而引起肺功能的降低。炎癥細(xì)胞因子及物質(zhì)是損傷氣道上皮和肺組織，引起氣道上皮剝離和氣道高反應(yīng)的主要因素[21-23]。本實(shí)驗(yàn)哮喘組外周血中白細(xì)胞計數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)和所占百分比高于對照組，且肺功能FEV0.4/FVC、用力最大流速及呼氣阻力低于對照組，哮喘組BALF及肺組織中TH2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5濃度高于對照組，而哮喘組IFN-γ的濃度低于對照組，表明多種炎性細(xì)胞及炎性細(xì)胞組分的失衡參與了哮喘的發(fā)生及發(fā)展。

糖皮質(zhì)激素在哮喘的急性發(fā)作期是最有效的緩解藥物[24]，主要作用機(jī)制在于抑制細(xì)胞炎性因子的合成及釋放，阻止炎癥細(xì)胞的趨化等，但用藥時間長，產(chǎn)生的副作用較多[25-26]。近年來，中藥治療哮喘逐漸成為研究熱點(diǎn)，然而中藥制劑中有效成分、作用方式等具體機(jī)制尚不明確。哮喘的發(fā)病與多種炎性介質(zhì)、細(xì)胞因子及炎性細(xì)胞的活動有關(guān)。因此從調(diào)整機(jī)體免疫功能及抗炎癥因子的釋放的途徑來治療哮喘，成為選擇中藥治療哮喘方向。本實(shí)驗(yàn)通過選取具有抗炎及具有免疫調(diào)節(jié)作用的中藥白藜蘆醇，白藜蘆醇是一種多酚類化合物，在自然界中普遍存在，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗癌、抗脂質(zhì)過氧化及抗氧化應(yīng)激等多種藥理活性。本文中給予誘導(dǎo)哮喘的小鼠白藜蘆醇腹腔注射，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇組外周血中白細(xì)胞計數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)和所占百分比較哮喘組明顯減低，且肺功能FEV0.4/FVC、用力最大流速及呼氣阻力比哮喘組明顯提高；白藜蘆醇組BALF及肺組織中TH2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5濃度低于哮喘組，而TH1型細(xì)胞因子IFN-γ濃度高于哮喘組，說明白藜蘆醇可能通過維持TH1/TH2細(xì)胞因子的平衡及提高免疫功能抑制TH2型炎性因子的合成，而促進(jìn)TH1型炎性因子的合成與釋放，從而起到治療作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示中藥白藜蘆醇能夠抑制TH2型炎性因子IL-4、IL-5的合成，而促進(jìn)TH1型炎性因子IFN-γ的合成與釋放，維持TH1/TH2的平衡及提高免疫功能，改善肺功能。為支氣管哮喘治療提供了新措施。