重組改構(gòu)人腫瘤壞死因子治療惡性胸腔積液的療效及其在其中的價(jià)值

俞玲 桑琳莉 徐興祥 許文景 楊俊俊

惡性胸腔積液(malignant pleural effusion, MPE)是惡性腫瘤常見的并發(fā)癥[1]，多見于晚期肺癌、乳腺癌和淋巴瘤患者，具有反復(fù)產(chǎn)生的特點(diǎn)，導(dǎo)致患者出現(xiàn)進(jìn)行性加重的呼吸困難，同時(shí)可能伴有胸痛、咳嗽、厭食、煩躁不安，患者的生活質(zhì)量明顯下降，生存期較短[2-3]。

重組改構(gòu)人腫瘤壞死因子(recombinant mutated human tumor necrosis factor, rhmTNF)是一種廣譜抗腫瘤藥物，已廣泛應(yīng)用于惡性腫瘤及惡性胸腔積液患者的治療[4-7]。在前期臨床應(yīng)用及研究中我們發(fā)現(xiàn)多數(shù)惡性胸腔積液患者應(yīng)用rhmTNF進(jìn)行胸腔灌注治療效果理想，但存在一部分患者治療效果不理想的情況。CD133是一種公認(rèn)的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物，在多種腫瘤組織中有表達(dá)，有研究證實(shí)CD133+細(xì)胞與腫瘤免疫逃逸、藥物耐受及放化療抵抗等機(jī)制相關(guān)[8-9]。

由于腫瘤干細(xì)胞容易對治療不敏感，惡性胸腔積液中腫瘤細(xì)胞干性強(qiáng)的患者也可能對rhmTNF治療具有不敏感性。為驗(yàn)證這一假說，本文通過檢測治療前胸水中腫瘤細(xì)胞的CD133表達(dá)情況，并與rhmTNF治療惡性胸水療效指標(biāo)進(jìn)行比較，旨在為篩選rhmTNF治療優(yōu)勢人群提供參考。

材料和方法

一、研究對象

選取2013年1月至2014年7月?lián)P州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院呼吸科經(jīng)病理確診、伴有惡性胸腔積液的腫瘤患者38例作為研究對象。男性24例，女性14例，年齡38歲～82歲；肺腺癌25例，肺鱗癌6例，肺小細(xì)胞癌2例，淋巴瘤1例，乳腺癌1例，賁門腺癌1例，胃腺癌1例，前列腺癌1例。

二、治療方案

胸腔置管閉式引流，抽盡胸腔積液后，給予rmhTN(天恩福，上海唯科生物制藥有限公司)300萬IU/次，生理鹽水30～50 ml稀釋后胸腔注射，每3 d 1次，連續(xù)給藥3～4次為1個(gè)療程。所有患者僅治療1個(gè)療程，治療結(jié)束后4周評價(jià)客觀療效。38例患者中有15例患者予聯(lián)合全身化療，其余23例患者予以支持治療。

三、腫瘤細(xì)胞及CD133+細(xì)胞的富集與鑒定

參考本課題組前期操作方法[10-11]，在無菌條件下行胸腔穿刺術(shù)抽取胸腔積液，每份樣本的標(biāo)準(zhǔn)采集量為10 ml。采用人胸腔積液、腹腔積液腫瘤細(xì)胞差減富集試劑盒進(jìn)行胸腔積液中的腫瘤細(xì)胞富集，采用免疫熒光染色-染色體熒光原位雜交(immunostaining-FISH, iFISH)腫瘤細(xì)胞檢測試劑盒及人固態(tài)腫瘤干細(xì)胞CD133免疫熒光染色試劑盒對富集到的腫瘤細(xì)胞及CD133+細(xì)胞進(jìn)行染色鑒定并計(jì)數(shù)。

四、觀察指標(biāo)

1. 療效判定參照世界衛(wèi)生組織(WHO)惡性漿膜腔積液的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn): 完全緩解(complete remission, CR)，漿膜腔積液消失；部分緩解(partial remission, PR)，積液總量減少≧50%；穩(wěn)定(stable disease, SD)，積液量無變化，減少<50%，或者增加<25%；進(jìn)展(progressive disease, PD)，積液量增加≧25%。總有效率(overall response rate, ORR)=(CR+PR)例數(shù)/總例數(shù)×100%，疾病控制率(disease control rate, DCR)=(CR+PR+SD)例數(shù)/總例數(shù)×100%。

2. 無進(jìn)展生存期(progression free survival, PFS)定義： 患者從接受治療開始到出現(xiàn)腫瘤進(jìn)展或死亡的時(shí)間；總生存期(overall survival, OS)的定義是指從患者從接受治療開始至死亡的時(shí)間。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件分析，組間計(jì)數(shù)資料比較用χ2檢驗(yàn)，因患者數(shù)小于40例，采用Fisher的精確檢驗(yàn)；對無進(jìn)展期(progression free survival, PFS)及總生存期(OS)評估應(yīng)用生存分析Kaplan-Meier曲線法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

結(jié) 果

一、38例MPE患者臨床特征與rmhTNF療效的關(guān)系

38例患者中，CR病例0例，PR病例16例，SD病例18例，PD病例4例，總的ORR為42.11%。總的DCR為89.47%。患者臨床特征與rmhTNF療效的關(guān)系，見表1。因38例患者中肺腺癌25例，肺鱗癌6例，肺小細(xì)胞癌2例，淋巴瘤1例，乳腺癌1例，賁門腺癌1例，胃腺癌1例，前列腺癌1例，非肺腺癌的病例較少，在對比病理類型與rmhTNF療效關(guān)系時(shí)，只對比了肺腺癌及非肺腺癌患者的療效，兩者的ORR及DCR無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別；PS評分(0-1)的患者的DCR為100.00%，PS評分(2-3)的患者的DCR為83.33%，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；RmhTNF單藥治療的患者，ORR為26.09%，DCR為82.61%，RmhTNF聯(lián)合全身化療的患者，ORR為66.67%，DCR為100%，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、38例MPE患者臨床特征影響無進(jìn)展期和總生存期的分析

38例患者的PFS中位數(shù)為2月，OS中位數(shù)為4月，用生存分析Kaplan-Meier曲線法對變量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)性別、年齡、PS評分、病理類型、吸煙史對PFS及OS沒有影響，但治療方式有影響，rmhTNF單藥胸腔灌注患者PFS中位數(shù)為1月，OS中位數(shù)為2月，rmhTNF胸腔灌注聯(lián)合全身化療化療PFS中位數(shù)為5月，OS中位數(shù)為8月，兩種不同治療方式患者PFS(P<0.001)及OS(P<0.001)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別,不同治療方式的PFS及OS生存曲線圖，見圖1、圖2。

圖1 不同治療方式患者的PFS生存曲線

表1 38例MPE患者臨床特征與rhmTNF療效的關(guān)系

注：aP<0.05

圖2 不同治療方式患者的OS生存曲線

三、CD133與療效、無進(jìn)展期和總生存期的關(guān)系

人胸腔積液中的腫瘤細(xì)胞經(jīng)人胸腔積液、腹腔積液腫瘤細(xì)胞差減富集試劑盒進(jìn)行富集后，采用免疫熒光染色-染色體熒光原位雜交(immunostaining-FISH, iFISH)技術(shù)進(jìn)行腫瘤細(xì)胞鑒定，熒光顯微鏡下可見8號染色體著絲粒探針(chromosome 8 centromere probe, CEP8)信號，且染色體信號為多倍體，見圖3。胸腔積液中腫瘤細(xì)胞富集后進(jìn)行CD133、CK免疫熒光染色，鏡下可見CD133+CK+表達(dá)腫瘤細(xì)胞，見圖4。全組患者胸腔積液中CD133+細(xì)胞數(shù)為0-7 080個(gè)/10 ml，22例患者惡性胸水中檢測到CD133+腫瘤細(xì)胞，16例患者惡性胸水中未檢測到CD133+腫瘤細(xì)胞。未檢測到CD133+腫瘤細(xì)胞的患者應(yīng)用rhmTNF治療后MPE的ORR及DCR較檢驗(yàn)到CD133+腫瘤細(xì)胞患者要高，未檢測到CD133+腫瘤細(xì)胞的患者PFS及OS較CD133+患者長，見表2、圖5、6。

圖3 患者胸腔積液腫瘤細(xì)胞差減富集后iFISH染色熒光圖(紅色代表CEP8探針信號，藍(lán)色代表DAPI染色細(xì)胞核)；注：A:可見細(xì)胞內(nèi)有5個(gè)CEP8信號，判定為五倍體；B：可見細(xì)胞內(nèi)有3個(gè)CEP8信號，判定為三倍體

圖4 患者胸腔積液腫瘤細(xì)胞差減富集后CD133、CK染色熒光圖(紅色代表CD133表達(dá)陽性，綠色代表CK表達(dá)陽性，藍(lán)色代表DAPI染色細(xì)胞核)；注：A中可見CD133+CK+表達(dá)腫瘤細(xì)胞；B：中分別可見CD133-CK+及CD133+CK+表達(dá)腫瘤細(xì)胞

表2 CD133表達(dá)與MPE患者療效及預(yù)后的關(guān)系

圖5 CD133+/-患者的PFS生存曲線

討 論

腫瘤壞死因子是由巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞等細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，是目前認(rèn)為最強(qiáng)的殺傷腫瘤細(xì)胞的因子，它通過與細(xì)胞表面TNF-α受體結(jié)合，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。rmhTNF和野生型TNF-α相比，敲除了N端前7個(gè)氨基酸殘基，對第 8、9、10及第157位氨基酸進(jìn)行了置換，改構(gòu)后的rmhTNF抗腫瘤活性較野生型提高10倍，而毒副反應(yīng)下降5倍,其不良反應(yīng)遠(yuǎn)低于野生型TNF[12]。很多臨床研究和實(shí)踐觀察表明，采用rmhTNF 局部灌注治療惡性胸腔積液安全、有效。張偉京等[13]應(yīng)用rmhTNF-NC注射液單藥靜脈輸液或局部應(yīng)用治療惡性腫瘤，包括惡性淋巴瘤，惡性胸腹水，惡性黑色素瘤，肺癌，肝癌，乳腺癌，結(jié)腸癌和腎癌，發(fā)現(xiàn)注射用rmhTNF治療惡性淋巴瘤和惡性胸腹水療效明確，對肺癌、惡性黑色素瘤也有一定療效， 其中惡性胸腹水的有效率更高，提示可能與局部用藥藥物濃度更高有關(guān)。秦叔逵等[14]對應(yīng)用rmhTNF單藥腔內(nèi)灌注治療985例惡性胸、腹腔積液進(jìn)行了對比分析，發(fā)現(xiàn)采用rmhTNF-NC單藥灌注治療惡性胸、腹腔積液有效，其安全性、耐受性好，尤其對于初治患者和惡性胸腔積液的療效更佳。

圖6 CD133+/-患者的OS生存曲線

在前期臨床應(yīng)用及研究中我們也發(fā)現(xiàn)多數(shù)惡性胸腔積液患者應(yīng)用rhmTNF進(jìn)行胸腔灌注治療效果較理想，但是存在一部分患者治療效果不理想，甚至有的患者病情惡化的情況。該類藥物價(jià)格昂貴，且臨床工作中應(yīng)盡量避免無效的治療，所以進(jìn)一步提高對藥物療效的預(yù)測能力成為目前急需解決的問題。通過回顧性分析我們發(fā)現(xiàn)在治療MPE患者時(shí)，rmhTNF聯(lián)合全身化療能取得較rmhTNF單藥胸腔灌注更好的療效和預(yù)后。患者PS評分0-1的患者較PS評分2-3分的患者在應(yīng)用rmhTNF治療MPE時(shí)能獲得更好的控制率，提示在患者身體狀況允許的情況下應(yīng)用rmhTNF胸腔灌注聯(lián)合全身化療治療MPE能取得更好的療效和預(yù)后。

CD133是一種公認(rèn)的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物，在多種腫瘤組織中有表達(dá)，有研究證實(shí)CD133+細(xì)胞與腫瘤免疫逃逸、藥物耐受及放化療抵抗等機(jī)制相關(guān)，并與多種惡性腫瘤的療效和預(yù)后有關(guān)。Zhang 等[15]通過Meta分析得出CD133高表達(dá)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者總生存期短，治療預(yù)后差。Fathi等[16]發(fā)現(xiàn)CD133+的結(jié)直腸癌患者臨床分期差，更易發(fā)生淋巴及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。Hashimoto 等[17]發(fā)現(xiàn)CD133在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)與胃癌的進(jìn)展和預(yù)后不良有關(guān)。在肺癌方面， Mizugaki等[18]發(fā)現(xiàn)CD133表達(dá)與患者的臨床分期相關(guān)，認(rèn)為CD133+表達(dá)是非小細(xì)胞肺癌的潛在預(yù)后標(biāo)志物。Wu等[19]通過系統(tǒng)評價(jià)和Meta分析也發(fā)現(xiàn)CD133表達(dá)是非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后標(biāo)志物。Kubo等[20]發(fā)現(xiàn)表達(dá)CD133和CD87的小細(xì)胞肺癌細(xì)胞亞群顯示對化學(xué)療法的抵抗性。在我們的研究中，發(fā)現(xiàn)胸水中檢測到CD133+腫瘤細(xì)胞的患者應(yīng)用rmhTNF治療MPE的療效和預(yù)后都要比未表達(dá)CD133的患者差。Hilbe 等[21]研究發(fā)現(xiàn)在CD133+細(xì)胞增多的非小細(xì)胞肺癌病理組織中，部分CD133+細(xì)胞排列呈管狀， 指出非小細(xì)胞肺癌患者組織中的CD133+內(nèi)皮祖細(xì)胞可能是促進(jìn)血管生成和腫瘤生長的病因，而Stathopoulos 等[22]通過研究發(fā)現(xiàn)TNF-α可以激活NF-κβ途徑，從而抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，另一方面使TNF-α可上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的表達(dá)，VEGF是誘導(dǎo)血管生成的強(qiáng)大的促進(jìn)因子，可促進(jìn)腫瘤新生血管的形成，從而促進(jìn)胸水的產(chǎn)生。由此我們推測在應(yīng)用rmhTNF治療CD133+MPE患者時(shí)，CD133+腫瘤細(xì)胞與TNF可能具有促進(jìn)血管生成的協(xié)同效應(yīng)，從而導(dǎo)致療效及預(yù)后相對較差。

綜上所述，胸水中檢測出CD133+腫瘤細(xì)胞可能是應(yīng)用rmhTNF治療MPE患者的不利因素，另外在條件允許的情況下采用rmhTNF胸腔灌注聯(lián)合全身化療治療MPE能取得較rmhTNF單藥胸腔灌注更好的療效和預(yù)后。