慢性阻塞性肺疾病患者肋間外肌線粒體相關功能的臨床研究

葉斌 李福祥

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一種局部氣流受限為特征的肺部疾病，表現為呼吸道或肺實質炎性反應，可進一步發展成為肺心病和呼吸衰竭，嚴重影響患者的日常生活和工作[1-3]。COPD發病率和死亡率較高，居全球致死性疾病第四位[4-5]，預計到2020年，其將上升至第三位[6]。因此，加強對COPD的防治意義重大。

COPD主要是多種細胞因子和炎癥介質(如IL-1、IL-8、TNF-α等)[7-10]以及黏附分子(如CD11b/CD18、β2整合素等)[11-15]共同參與和發展所致。COPD不僅會導致肺部受損及肺功能下降，也常會引起肺外不良反應，尤以營養不良和呼吸肌功能障礙為主。線粒體作為機體活動和代謝所需能量和自由氧主要提供者，在呼吸肌功能障礙中起到至關重要的作用[16]。那么營養不良是否會導致機體所需能量不足，從而加重COPD病情，目前尚無相關研究。本文旨在探討不同營養狀況COPD患者呼吸肌線粒體功能，以期為COPD防治提供指導。

資料與方法

一、研究對象

于2016年1月至2016年12月收治于成都軍區總醫院呼吸科及胸外科且符合入選條件的COPD患者20例。其中低BMI COPD(BMI<18.5)患者10例，年齡46～84歲，平均年齡(58.4±14.8)歲；正常BMI COPD患者10例(18.5

二、診斷標準

診斷標準參照慢性阻塞性肺疾病全球倡議(global initiative for obstructive lung disease, GOLD)頒布的《慢性阻塞性肺疾病診治指南(2016修訂)》和中華醫學會呼吸病學會慢性阻塞性肺疾病學組織的《慢性阻塞性肺疾病診治指南(2013修訂)》：對患者進行詳細的病史采集，包括癥狀、接觸史及既往史和系統回顧，癥狀包括慢性咳嗽、咳痰和氣短，既往史和系統回顧包括童年期有無變態反應性疾病、感染及其他呼吸道疾病史，接觸史包括吸煙史、職業環境等，并根據上述資料綜合分析確定；COPD確診的金標準：肺功能檢查，吸入支氣管擴張劑后，FEV1/FVC%<70%，可以確定患者存在持續氣流受限。

三、納入排除標準

1. 納入標準： ①符合上述診斷標準者；②年齡40～85歲者；③無肺心病者；④患者完全知情且能積極配合本實驗者。

2. 排除標準： ①伴有支氣管哮喘或其他呼吸系統疾病患者；②伴有冠狀動脈疾病；③伴有慢性代謝性、腎、心臟疾病或神經肌肉疾病；④近3個月內有全身類固醇治療史，或影響肌肉結構和功能的藥物；⑤近1月有呼吸道感染史；⑥胸廓畸形。

四、臨床方法

1. 三組患者基本情況評估

(1)肺功能檢查： 所有患者均接受常規肺功能檢測，測定用力肺活量、肺活量、第1 s用力呼氣容積(FEV1)、1秒率、彌散功能等。

(2)血氣分析： 血氣分析血樣從患者橈動脈抽取2 ml，應用血氣分析儀測定患者血氣指標(pH、PaO2、PaCO2)。

2. 肋間外肌基本情況評估: 患者全麻后，行胸腔鏡術或開胸手術，取第4肋間的肋間外肌組織，分成四份。精密稱取1 g組織用于測定IL-6、IL-8和TNF-α表達水平；選取2 mm×2 mm×2 mm組織置于10%甲醛固定，行光鏡檢測肋間外肌形態；稱取1 g新鮮肋間外肌提取線粒體，測定線粒體蛋白含量、呼吸鏈Ⅰ-Ⅳ和超氧化物歧化酶SOD活性、線粒體膜通透性轉換孔(MPTP)動力學；選取1×1×1毫米組織置于3%戊二醛4 ℃保存，送四川大學電鏡室檢測肋間外肌線粒體形態。

3. IL-6、IL-8和TNF-α的測定: 將選取的肋間外肌組織剪碎、沖洗、研碎，反復凍融裂解組織細胞，5 000×g離心5 min，取上清，-20 ℃保存，應用IL-6、IL-8和TNF-α試劑盒，按實驗步驟測定。

4. 肋間外肌形態學觀察: 將選取的肋間外肌組，投入10%福爾馬林中凝固24 h，按照脫水透明、浸蠟、包埋、切片、展片與貼片、脫蠟與復水、染色、水洗、分化、漂洗、封片與觀察等步驟觀肋間外肌形態學。

5. 肋間外肌線粒體功能評估: 應用組織活性線粒體分離試劑盒提取線粒體，應用純化線粒體蛋白質濃度定量試劑盒測定蛋白濃度，應用線粒體復合酶Ⅰ-Ⅳ和超氧化物歧化酶SOD活性的測定試劑盒測定，應用線粒體通透性轉換孔(MPTP)動力學測定

6. 肋間外肌線粒體結構的觀察: 將選取作電鏡觀察的肋間外肌組織標本，按照固定、脫水、包埋、固定、切片、染色、透射電鏡觀察，拍片等步驟進行肋間外肌線粒體結構的觀察。

五、統計學方法

結 果

一、患者病情評估結果

1. 三組患者基本情況比較： 三組患者的例數、性別、年齡和吸煙指數臨床資料相比，差異無統計學意義(P>0.05)；低BMI COPD組的BMI指數值顯著低于正常BMI COPD組和非COPD對照組(P<0.05)，而正常BMI COPD組與非COPD對照組無顯著性差異(P>0.05)，見表1。

表1 三組患者基本情況比較

注：aP<0.05，與非COPD對照組相比；bP<0.05，與正常BMI COPD組相比

2. 肺功能評估結果: 三組患者肺功能參數測定結果，見表2。與非COPD對照組相比，COPD患者的肺功能參數值均明顯降低(P<0.05)；低BMICOPD組和正常BMI COPD組患者的FVC(%)和VC(%)無顯著性差異(P>0.05)，而FEV1(%)、FEV1/預測值、FEV1/FVC和DLco顯著低于正常BMI COPD組(P<0.05)。

3. 血氣分析結果: 三組COPD患者血氣分析結果，見表3。血液pH指標結果顯示：正常BMI COPD組與非COPD對照組無顯著性差異(t=3.464，P=0.074)，而低BMI COPD組顯著低于正常BMI COPD組和非COPD對照組(t=8.660，P=0.013 &t=12.124，P=0.007)；PaO2測定結果顯示：COPD患者組顯著低于非COPD對照組(P<0.05)，低BMI COPD組顯著低于正常BMI COPD組(t=17.321，P=0.003)；PaCO2測定結果顯示：正常BMI COPD組與非COPD對照組差異無統計學意義(t=2.784，P=0.108)，低BMI COPD組顯著高于正常BMI COPD組和非COPD對照組(t=6.447，P=0.023 &t=4.409，P=0.048)。

表3 三組血氣分析測定值對比±s)

注：aP<0.05，與非COPD對照組比較；bP<0.05，與正常BMI COPD組比較;cP<0.05，vs. 非COPD對照組相比

二、肋間外肌基本情況評估

1. 肋間外肌IL-6、IL-8和TNF-α濃度對比: 三組患者肋間外肌IL-6、IL-8和TNF-α濃度測定結果，見表4。COPD患者組的IL-6、IL-8和TNF-α表達水平顯著高于非COPD對照組(P<0.05)，低BMI COPD組的IL-6、IL-8和TNF-α表達水平顯著高于正常BMI COPD組(t=4.869，P=0.040 &t=7.491，P=0.017 &t=11.525，P=0.007)。

2. 肋間外肌形態學觀察: 三組受試者肋間外肌光鏡圖，見圖1。非COPD對照患者肋間外肌肌細胞規則排列，肌橫紋清晰，細胞核分布于細胞邊緣，呈扁橢圓形，間質細胞較少，胞質染色均勻，見圖1a。正常BMI COPD患者肋間外肌肌細胞排列規則，肌橫紋略微模糊，細胞質染色略微不均，間質細胞較正常人多，見圖1b。低BMI COPD患者肋間外肌肌纖維間距增寬，呈不規則凹陷、分葉狀，并可見玻璃樣變性；間質細胞增多，局部肌橫紋可見模糊，胞質染色不均，偶有細顆粒狀、不規則空泡及旋渦狀，見圖1c。

表4 三組患者肋間外肌IL-6、IL-8和TNF-α濃度測定值±s)

注：aP<0.05，與正常組相比；bP<0.05，與正常BMI組相比;cP<0.05，vs. 非COPD對照組相比

三、肋間外肌線粒體功能評估

1. 肋間外肌線粒體蛋白含量: 三組受試者肋間外機線粒體蛋白含量測定結果顯示， 低BMI COPD組為0.63±0.06 μg/ml， 正常BMI COPD組為1.21±0.07 μg/ml， 非COPD對照組為1.58±0.05 μg/ml。對照組肋間外肌線粒體蛋白含量顯著高于COPD患者組(P<0.05)，而正常BMI COPD組線粒體蛋白含量顯著高于低BMI COPD組(t=11.162，P=0.008)。

表2 三組患者肺功能參數比較±s)

注：aP<0.05，與非COPD對照組相比；bP<0.05，與正常BMI COPD組相比;cP<0.05，vs. 非COPD對照組相比

2. 肋間外肌線粒體復合物Ⅰ-Ⅳ和超氧化物歧化酶SOD活性的測定: 三組患者肋間外肌線粒體復合酶活性測定結果，見表5。與對照組相比，正常BMI COPD組的線粒體復合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和SOD活性均顯著低于對照組(t=13.891，P=0.005 &t=16.338，P=0.004 &t=9.370，P=0.011 &t=22.200，P=0.002 &t=12.124，P=0.007)；低BMI COPD組線粒體復合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和SOD均顯著低于正常BMI COPD組(t=24.305，P=0.002 &t=16.788，P=0.004 &t=8.730，P=0.013 &t=13.863，P=0.005 &t=9.418，P=0.011)。

表5 三組肋間外肌線粒體復合酶活性測定結果±s)

注：aP<0.05，與非COPD對照組相比；bP<0.05，與正常BMI COPD組相比;cP<0.05，vs. 非COPD對照組相比

3. 線粒體膜通道孔(MPTP)動力學測定: 非COPD對照組患者MPTP隨著時間的進展，其吸光度值降低較少，而COPD患者組的MPTP減少較多，其中低BMI COPD患者MPTP降低最顯著(P<0.05)，見圖2。

圖2 三組患者線粒膜通道孔吸光度比值比較

4. 肋間外肌線粒體形態學觀察: 三組受試者肋間外肌線粒體電鏡觀察如圖3所示。非COPD對照患者肋間外肌線粒體形狀規則，外膜完整，嵴清晰可見，脂質空泡少見，未見膠原增生，圖3a。正常BMI COPD組患者肋間外肌線粒體偶見基質密度下降、腫脹，嵴減少，外膜局部模糊、破損，脂質空泡及膠原未見明顯增加，個別細胞現髓樣變，圖3b。低BMI COPD組患者肋間外肌線粒體數目略微增加，并呈簇狀分布，部分線粒體可見腫脹，嵴變形，部分溶解，基質空泡化，偶見髓樣變、膠原增多及脂質空泡增多現象，圖3c。

四、相關性分析

1. FEV1與炎性指標的Pearson相關性分析： 將三組患者的FEV1與炎性指標(IL-6、IL-8和TNF-α)相關性分析，得患者FEV1與IL-6、IL-8和TNF-α呈負相關，見表6。

表6 FEV1與炎性指標的相關性

2. FEV1與線粒體指標的Pearson相關性分析: 將三組患者FEV1與線粒體指標進行相關性分析，得到患者FEV1與線粒體呼吸鏈復合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和SOD呈正相關，見表7。

表7 FEV1與線粒體指標的相關性

討 論

近年來的研究發現，COPD病變的主要是以中性粒細胞、淋巴細胞和肺泡巨噬細胞浸潤為主的小氣道炎癥[17-18]，在吸煙、感染和吸入污染的空氣等的刺激下，氣道上皮受損，支氣管上皮細胞一方面分泌抗氧化和抗蛋白酶因子的功能下降[19]，另一方面IL-1、IL-8和TNF-α等多種細胞因子和炎性介質的釋放增加，介導刺激信號傳導至細支氣管，使肺泡中性粒細胞和巨噬細胞活化，并趨化于支氣管，而活化的中性粒細胞進一步釋放IL-8，導致炎癥信號逐級放大[7-8]，引起多種炎癥因子的釋放(如IL-6、IL-8和TNF-α等)，介導單核細胞趨化至肺，合成并釋放急性期反應蛋白，如CRP、TNF-α等，引起COPD的發生和發展[20]。

COPD在導致患者肺部受損、肺功能下降的同時，也可導致肺外不良反應[21]，如營養不良、肌肉萎縮、心血管疾病等[22]。其中呼吸肌功能障礙是近年來的研究熱點。骨骼肌功能紊亂(skeletal muscle dysfunction, SMD)是COPD患者常見的肺外不良反應[23]，導致COPD患者的運動受限[24-25]。研究表明，全身炎癥、氧化應激以及細胞缺氧等多種因素都會引起肢體肌肉異常[26-28]，部分COPD患者常常出現肌肉損失，嚴重影響患者的生命健康及預后。營養不良導致患者呼吸肌結構和功能受損，呼吸肌疲勞，限制肺通氣功能，引起患者進行性肌肉組織減少、呼吸肌萎縮。研究顯示，COPD患者外周骨骼肌Ⅱ型纖維比例的增加和Ⅰ型纖維損害呈正相關[29]。近年來研究顯示，多種細胞因子，如IL-6、IL-8和TNF-α等，對機體能量和物質代謝產生影響，引起COPD患者營養不良及呼吸肌功能紊亂[30-31]。Nguyen等[30]研究發現，營養不良COPD穩定期患者血清中及外周血單核細胞中TNF-α濃度均顯著高于正常患者，TNF-α系統的激活與COPD營養不良存在密切聯系。當機體受到炎癥刺激時，IL-6濃度顯著增高，損傷內皮血管，促進免疫黏附及微血管形成，抑制內皮修復，使血管受損加劇，肺功能惡化[32-33]。本研究發現，COPD患者組的IL-6、IL-8和TNF-α表達水平顯著高于非COPD對照組，低BMI COPD組的IL-6、IL-8和TNF-α表達水平顯著高于正常BMI COPD組。

光鏡觀察三組患者肋間外肌形態，發現正常人肋間外肌肌細胞規則排列，肌橫紋清晰，細胞核分布于細胞邊緣，呈扁橢圓形，間質細胞較少，胞質染色均勻；正常BMI患者肋間外肌肌細胞排列規則，肌橫紋略微模糊，細胞質染色略微不均，間質細胞較正常人多；低BMI患者肋間外肌肌纖維間距增寬，呈不規則凹陷、分葉狀，并可見玻璃樣變性；間質細胞增多，局部肌橫紋可見模糊，胞質染色不均，偶有細顆粒狀、不規則空泡及旋渦狀。上述結果說明COPD患者由于氣道受限，導致機體缺氧，導致COPD患者的呼吸肌細胞形態發生不同程度變化，且低BMI COPD組的變化較明顯。

肌肉的運動離不開線粒體源源不斷地合成ATP。線粒體最主要的功能是氧化各種底物，使儲存在其化學鍵中的能量進入ATP，提供機體活動和代謝所需的能量。COPD患者因為氣道呼吸受阻，導致機體缺血、缺氧，可能會影響線粒體功能的發揮[34]。Sauleda等[35]研究報道了線粒體電子傳遞鏈的末端酶-細胞色素氧化酶(COX)的活性在COPD患者骨骼肌中表達上調，與動脈低氧血癥呈正比。Gosker等[36]研究發現COPD患者骨骼肌中，促進質子泄露的蛋白通道，解偶聯蛋白3(在ATP合成、能量耗散等中具有氧化磷酸化脫離功能)的表達降低。Ribera等[35]研究顯示，在一些嚴重肺氣腫患者分離得到的呼吸肌纖維中，線粒體電子傳輸增加，線粒體功能發生改變。本研究發現，低BMI COPD組和正常BMI COPD組患者肋間外肌線粒體蛋白含量、線粒體復合酶Ⅰ-Ⅳ的活性、超氧化物歧化酶SOD活性、MPTP動力學均顯著低于非COPD對照組，而低BMI COPD組患者的線粒體蛋白含量、線粒體復合酶Ⅰ-Ⅳ及超氧化物歧化酶SOD的活性、MPTP動力學顯著低于正常BMI COPD組，說明COPD患者肋間外肌線粒體功能受到一定程度的影響，營養不良患者線粒體功能出現障礙較嚴重。肋間外肌線粒體形態學觀察顯示：正常受試者肋間外肌線粒體性狀規則，外膜完整，嵴清晰可見，脂質空泡少見，未見膠原增生。正常BMI COPD組患者肋間外肌線粒體偶見基質密度下降、腫脹，嵴減少，外膜局部模糊、破損，脂質空泡及膠原未見明顯增加，個別細胞線粒出現髓樣變。低BMI COPD組患者肋間外肌線粒體數目略微增加，并呈簇狀分布，部分線粒體可見腫脹，嵴變形，部分溶解，基質空殼，偶見髓樣變、膠原增多及脂質空泡增多現象。上述研究顯示，與非COPD對照組相比，COPD患者的呼吸肌線粒體功能受到一定程度影響，且營養不良COPD患者呼吸肌線粒體功能受到的影響較嚴重。

由于呼吸肌功能與呼吸肌線粒體功能往往存在一定的關系，但本實驗在研究BMI對肋間外肌線粒體功能的影響時，沒有對呼吸肌功能進行深入研究，所以在后續研究中應對呼吸肌功能進行充分研究，探討其在不同BMI的COPD患者中的不同，才能更好地為臨床COPD的防治提供依據。