益氣固本膠囊調控哮喘小鼠核因子κB信號通路腫瘤壞死因子α和白細胞介素1β含量的實驗研究

孔一卜， 孫麗平， 劉璐

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是呼吸系統常見的由多種炎性細胞、細胞因子及炎癥介質等共同參與的氣道慢性炎癥性疾病。氣道重塑是哮喘的主要病理改變，在其發病機制中起著重要的作用[1-3]，與哮喘反復發作密切相關。益氣固本膠囊是由國醫大師王烈教授驗方所研制，臨床效果顯著，可有效降低哮喘的發病率及復發病情[4-5]。前期相關實驗表明，本藥物可以調節免疫功能及白細胞介素4(interleukin-4，IL-4)、γ干擾素(interferon-γ，INF-γ)、轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)等哮喘病相關因子水平和蛋白表達[6-13]。更深入的研究在于對該病相關信號傳導通路中間匯聚點及下游信號調節作用的研究。核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)信號通路被認為是哮喘病的關鍵信號通路，參與哮喘氣道重塑的形成。相關研究表明哮喘發作與NF-κB被激活有關，炎癥介質腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)是NF-κB被活化過程中重要的刺激因子，其含量對于NF-κB的活性有一定的影響。因此本研究擬觀察益氣固本膠囊對哮喘模型小鼠血清、肺泡灌洗液中炎癥介質TNF-α、IL-1β含量的影響，探討益氣固本膠囊對NF-κB信號傳導通路活性的影響及推測其治療哮喘的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 BALB/c小鼠60只，雌雄不限，體質量18～20 g，由長春生物制品研究所有限責任公司提供[動物合格證號SCXK(吉)-2016-0008]。將60只BALB/c小鼠按隨機數字表法分為5組：正常對照組(10只)、模型組(14只)、益氣固本膠囊組(12只)、童康片組(12只)、地塞米松片組(12只)。

1.2 試劑與藥品 益氣固本膠囊(長春中醫藥大學附屬醫院，批號：20160301)；童康片(廣州康和藥業有限公司，批號：160304)；醋酸地塞米松片(天津力生制藥股份有限公司，批號：1603014)；卵清白蛋白(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，Sigma分裝，純度>90%，Lot：080M1705V)。

1.3 研究方法 哮喘模型參照文獻[8]制備。給藥方法：根據臨床用量，折算成小鼠的等效計量為益氣固本膠囊1.1 g/kg、童康片0.88 g/kg、地塞米松片0.1 mg/kg。將上述藥物分別配置成益氣固本膠囊55 g/L、童康片44 g/L、地塞米松片0.005 g/L的藥液后，按20 mL/kg給予益氣固本膠囊組、童康片組、地塞米松組小鼠灌胃。正常對照組、模型組給予等容積的純凈水灌胃。連續給藥30 d，致敏期間藥物組繼續給予上述藥物，正常對照組、模型組給予等容積的純凈水。激發方法：參照文獻[8]進行激發。每日激發1次，連續10 d，激發前1 h藥物組給予受試藥，正常對照組、模型組給予等容積的純凈水。

1.4 檢測指標

1.4.1 一般情況 觀察小鼠在制備哮喘模型及給藥期間體表、呼吸頻率、體溫、體質量的變化。

1.4.2 檢測指標 摘小鼠眼球取血3 000 r/min離心10 min，取血清，置于-80 ℃低溫冰箱中保存。收取小鼠肺泡灌洗液3 000 r/min離心5 min，取上清液，置于-80 ℃低溫冰箱中保存。用酶聯免疫吸附試驗法(ELISA)測定血清和肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β的含量。

2 結果

2.1 各組小鼠一般情況比較 制備哮喘模型后小鼠出現耳郭發紅，呼吸急促，體溫、體質量明顯下降，根據體征進行判斷，哮喘模型造模成功。經益氣固本膠囊、童康片、地塞米松片治療后，上述癥狀明顯改善。

2.2 各組小鼠血清中TNF-α、IL-1β含量的影響 見表1。

表1 各組小鼠血清中TNF-α、IL-1β含量的影響

注：與正常對照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05。

表1結果表明，模型組小鼠血清中TNF-α與正常對照組比較含量升高，差異有統計學意義(P<0.01)。益氣固本膠囊組、童康片組、地塞米松組小鼠血清中TNF-α與模型組比較含量降低，差異有統計學意義(P<0.05)。各組小鼠血清中IL-1β含量比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 各組小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β含量的影響 見表2。

表2 各組小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β含量的影響

注：與正常對照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05，cP<0.01。

表2結果表明，模型組小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β與正常對照組比較含量升高，差異有統計學意義(P<0.01)。益氣固本膠囊組、童康片組、地塞米松組小鼠泡灌洗液中TNF-α、IL-1β與模型組比較含量降低，差異有統計學意義(P<0.05)。

3 討論

中醫理論認為哮喘的反復發作與體內肺脾腎三臟功能失調而導致的痰飲內伏密切相關。伏痰留于體內，每遇誘因引觸，氣引痰動，痰氣交阻于氣道而發為哮喘。明代張景岳在《景岳全書·喘促》中記載：“喘有宿根，遇寒即發，或遇勞即發者，亦名哮喘”；《證因治要》中寫道：“哮病之因，痰飲留伏，結成窠臼，潛伏于內。”伏痰既是引起反復發作的內因，又是引起反復發作的宿根。西醫學認為氣道重塑是長期慢性炎癥作用于效應細胞所致，表現為內皮增生、基底膜增厚、平滑肌增生、基質沉積、血管改變等，是哮喘的重要病理改變，也是影響哮喘療效的重要因素之一。相關研究表明，部分氣道重塑的病理改變早在4歲哮喘患兒就可發生。從哮喘的病因及產生機制來看，伏痰宿根與氣道重塑均是因長期病理因素導致機體功能失調所致，具有發作期“活化”和緩解期“潛伏”的共同特征[14]。因此，可以推測中醫理論的“伏痰宿根”與西醫哮喘的“氣道重塑”具有一定的相關性，在治療上均可通過調節肺脾腎三臟功能祛伏痰、除宿根，而達到抑制氣道重塑的目的。

益氣固本膠囊由黃芪、玉竹、補骨脂、女貞子、太子參、五味子、牡蠣、大棗、佛手、山藥、熟地等藥物組成，諸藥合用達到補肺氣以清痰窠，健脾胃以絕痰源，補腎元以充肺根，可以有效的調節肺脾腎三臟功能，祛除宿根，防病反復，達到治療的目的。由于我們推測伏痰宿根與氣道重塑的形成具有一定的相關性，而氣道重塑的形成與NF-κB信號通路活性增強有關，因此本實驗選取NF-κB信號通路中的炎癥介質TNF-α、IL-1β作為研究對象做了相關實驗研究。實驗結果顯示，哮喘小鼠模型血清中TNF-α和肺泡灌洗液中的TNF-α、IL-1β含量均高于正常小鼠，在經益氣固本膠囊治療后呼吸急促等哮喘發作時的癥狀明顯的緩解，且血清中TNF-α和肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β含量降低，說明益氣固本膠囊治療哮喘的作用機制可能和調節TNF-α、IL-1β含量有關。

NF-κB通路被認為是哮喘病中關鍵信號轉導通路。該通路可以通過生長因子、細胞因子、炎性介質、嗜酸性粒細胞趨化因子等作用滲透于氣道重塑機制的多個環節和層面，參與氣道重塑的過程[15]。NF-κB信號通路活性的增強已經在哮喘性過敏性實驗模型和患者中證實。NF-κB是細胞內重要的核轉錄因子，通常與IκB形成復合體以無活性的方式存在于細胞漿中。TNF-α、IL-1β是對NF-κB活化響應的炎癥介質，可以通過刺激氣道平滑肌細胞及成纖維細胞，參與氣道重塑的形成。當哮喘發作時，細胞受到外界炎癥刺激后，使得IκB被磷酸化，NF-κB由抑制狀態被激活，誘導炎癥介質TNF-α、IL-1β等相關基因的轉錄，促進炎癥介質的合成，增多的炎癥介質作為外界刺激，進一步增強NF-κB的活性[16]。

因此我們推測，小鼠在造成哮喘模型后出現TNF-α、IL-1β含量增多及呼吸急促等癥狀可能與NF-κB信號通路被激活有關，而經益氣固本膠囊治療后TNF-α、IL-1β含量減少且呼吸急促等癥狀緩解，說明益氣固本膠囊可能通過調節哮喘小鼠體內TNF-α、IL-1β含量來抑制NF-κB信號通路活性從而發揮治療哮喘的作用。益氣固本膠囊可以去除宿根伏痰，而宿根伏痰與氣道重塑又有一定的相關性，氣道重塑的形成與NF-κB信號通路被激活有關，因此我們進一步推測益氣固本膠囊治療哮喘的作用機制也可能和調節NF-κB信號通路活性從而抑制氣道重塑有關，其作用機制有待于進一步探討。