不同時機俞募穴速刺對腦損傷大鼠腦組織白細胞介素6和腫瘤壞死因子α表達的影響

郭素真， 馬丙祥， 李瑞星， 李華偉， 陳恬恬， 張晰， 葉玉香

腦性癱瘓(簡稱腦癱)是一組持續存在的中樞性運動和姿勢發育障礙、活動受限證候群，這種證候群是由于發育中的胎兒或嬰幼兒腦部非進行性損傷所致。多伴有感覺、知覺、認知、交流和行為障礙及癲癇、繼發性肌肉骨骼問題[1]。腦癱的病因多與圍生期窒息、早產、出生低體質量、感染、病理性黃疸、顱內出血、先兆流產、多胎等因素有關[2]。其中，早產和宮內感染是腦癱發生的重要因素之一。有研究顯示，在低、中等收入國家早產兒的發生率可達15%以上[3-4]，我國的早產兒出生率約為8.1%[5]。李曉捷等[6]研究發現通過對孕鼠腹腔注射脂多糖，可造成早產腦損傷模型仔鼠，從而為研究宮內感染造成腦損傷的機制提供了途徑和方法。目前對小兒腦癱的治療，我國主要采用中醫傳統的康復方法和現代的康復技術相結合的方法。針灸作為傳統特色療法在其中發揮了重要的作用。本研究通過觀察不同時間點及療程俞募穴速刺對宮內感染/炎癥致早產腦損傷大鼠腦組織中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)和白細胞介素6(interleukin-6,IL-6)表達的影響，探討俞募穴速刺對神經元的保護作用及療效機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級成熟雄性SD大鼠15只，體質量(300±50)g；SPF級成熟雌性SD大鼠30只，體質量(250±50)g，由鄭州大學動物實驗中心購入，動物合格證號：SCXK(豫)2015-0004。

1.2 主要試劑與儀器 脂多糖(Sigma)；TNF-α抗體(博士德)；IL-6抗體(博奧森)；針灸針(天協牌，0.30 mm×30 mm)。自動包埋機EG1150；石蠟切片機RM2245；攤片機HII220；烘片機HII220；BH-2光學顯微鏡；徠卡倒置顯微鏡DMIL；圖像分析系統(Image-Pro Plus)。

1.3 造模與分組 參照李曉捷等[6]研究方法建立宮內感染/炎癥致早產仔鼠腦室旁白質軟化模型。適應性飼養3 d后，于17:00按雌雄比2∶1將大鼠進行合籠。次日上午8時取雌鼠陰道脫落細胞于光學顯微鏡下觀察，以鏡下觀察到大量絲狀精子和落葉狀角質細胞記為孕第0天。共檢出懷孕大鼠20只，按隨機數字表法選取6只孕鼠為生理鹽水組，其余14只孕鼠為脂多糖組。在孕鼠孕期的第16、17天連續2 d行腹腔注射，脂多糖組按照350 μg/(kg·d)注射脂多糖，生理鹽水組注射等量生理鹽水，仔鼠出生后記錄孕鼠分娩時間及仔鼠體質量，以胎齡≤21 d的仔鼠記為早產仔鼠。分娩當天取脂多糖組及生理鹽水組仔鼠各6只行腦組織病理學檢測。確定造模成功后，取早產仔鼠40只按隨機數字表法分為早短期針刺組(n=10)、晚短期針刺組(n=10)、長期針刺組(n=10)、模型對照組(n=10)；取正常足月仔鼠為空白對照組(n=10)。

1.4 分組干預 所有仔鼠同等條件喂養，空白對照組及模型對照組每日按針刺組方法固定1次，不針刺。各針刺組取俞募穴，以速刺手法進行干預，每日1次，早短期針刺組從生后第1天開始干預，連續針刺7 d；晚短期針刺組從生后第15天開始干預，連續針刺7 d；長期針刺組從生后第1天開始干預，連續針刺21 d；模型對照組和空白對照組不給予針刺干預，各組大鼠均于21日齡取材檢測腦組織IL-6和TNF-α。

俞募穴速刺方法：參照《實驗針灸學實驗指導》定位[7]，選穴：心俞、脾俞、腎俞、關元、中脘和中極。根據穴位針刺的方向和深度要求采用快速進針、快速出針、不留針的針刺方法。其中心俞、脾俞、腎俞直刺6 mm不留針。關元、中脘、中極直刺2 mm不留針。

1.5 標本制備及實驗室檢查

1.5.1 標本制備 仔鼠出生即刻，選脂多糖組和生理鹽水組孕鼠各2只，取子宮及胎盤放置于10%中性甲醛中固定；選脂多糖組早產鼠和生理鹽水組足月產仔鼠各6只，在冰盒上斷頭取腦組織，冷生理鹽水沖洗數次后，取腦組織于耳間線前2 mm水平處行冠狀切片，取組織厚度約3 mm，10%中性甲醛固定。仔鼠于21日齡腹腔注射10%的水合氯醛麻醉后，取材及處理方法同上。

1.5.2 病理學檢測 取固定好的子宮、胎盤及生后即刻處死的仔鼠腦組織，進行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，切片厚度3 μm，60 ℃溫箱過夜烤片。常規HE染色，光鏡下觀察子宮、胎盤情況及腦室旁白質損傷情況。

1.5.3 免疫組織化學檢測 取21日齡仔鼠腦組織，進行脫水、透明、梯度浸蠟、包埋、切片、烤片。取組織切片進行脫蠟、水化、3%H2O2室溫孵育10 min；5%BSA封閉液室溫封閉20 min；孵IL-6一抗或TNF-α一抗(1∶100)，37 ℃恒溫60 min；磷酸鹽緩沖液4 min×3次；孵二抗37 ℃恒溫箱孵育40 min；磷酸鹽緩沖液4 min×3次；辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37 ℃恒溫孵育30 min；磷酸鹽緩沖液4 min×3次；DAB室溫顯色，鏡下控制反應時間，蒸餾水洗滌；蘇木素復染2 min，自來水進行沖洗；脫水，透明，中性樹脂封固后，高倍顯微鏡下觀察腦組織中IL-6和TNF-α的表達，以細胞漿有棕黃色顆粒沉著為陽性表達，每張切片隨機選取5個區域采用美國Image-Pro Plus軟件進行光密度值測定，取平均光密度值(mean optical density value，MOD)。

2 結果

2.1 一般情況觀察 14只脂多糖組孕鼠中，1只在注射脂多糖次日陰道出血，娩出死亡胎鼠，3只在注射脂多糖后死亡，1只足月分娩，予以剔除，其余9只脂多糖組雌鼠均于孕22 d前分娩。共產出77只早產仔鼠，其中死產仔鼠25只。對照組6只雌鼠全部足月分娩，共產出60只足月產仔鼠，無死產仔鼠。

2.2 新生仔鼠情況 脂多糖組所產仔鼠與對照組出生體質量低，活產仔鼠少。脂多糖組仔鼠出生時皮膚顏色暗紅或紫紺，活動少。對照組仔鼠出生時體質量比脂多糖組高、活動比脂多糖組頻繁、應激反應比脂多糖組快，皮膚紅潤。

2.3 病理學觀察 子宮及胎盤HE染色示：生理鹽水組孕鼠子宮及胎盤組織未見明顯炎癥反應，未見大量中性粒細胞浸潤。脂多糖組孕鼠子宮壁及胎盤可見大量的中性粒細胞浸潤，血管充血。

新生仔鼠腦組織病理結果：對照組仔鼠腦組織結構完整，細胞排列均勻整齊，胞核較大。脂多糖組仔鼠腦室旁白質結構稀疏，細胞水腫，神經纖維排列不齊，神經元數目少，可見角質細胞聚集，側腦室出血改變。

2.4 各組仔鼠腦組織免疫組織化學指標比較 見表1。

表1 各組仔鼠腦組織免疫組織化學指標比較

表1結果表明，各針刺組下調腦組織中IL-6和TNF-α的表達，與模型對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)；長期針刺組IL-6和TNF-α表達的下調優于短期針刺組，差異有統計學意義(P<0.05)；早短期針刺組IL-6和TNF-α表達的下調優于晚短期針刺組，差異有統計學意義(P<0.05)。

3 討論

近年來研究發現，宮內感染/炎癥是導致腦癱發生的高危險因素[8]，宮內感染常伴有腦缺氧缺血，在此過程中促炎癥細胞因子可以造成急性腦白質損傷，而因此導致的腦室旁白質軟化。腦室旁白質軟化是早產兒中最具代表性的腦白質損傷，而炎癥反應在早產兒腦室旁白質軟化的發病機制中起到重要作用[9]。IL-6、TNF-α是導致腦室旁白質軟化發生的兩個最常見炎性細胞因子，這些炎性細胞因子通過損傷未成熟的少突膠質細胞或者間接的小膠質細胞活化引起的白質損傷，從而直接影響胎兒大腦發育及神經系統發育[10]。宮內感染時IL-6、TNF-α等炎性因子的升高，與胎兒腦白質損害呈正相關[11]。何柳芳等[12]認為在炎性反應導致腦室旁白質軟化發生的過程中，TNF-α是最早釋放的促炎癥因子，參與了腦損傷炎性反應的整個過程，且研究表明TNF-α增加較IL-1β更早一些。它可刺激小膠質細胞和星形膠質細胞的增殖，增加其他細胞因子的表達及促使活性氧、活性氮的增加，致使少突膠質細胞損傷的發生。早期干預可減輕腦損傷高危兒的神經損傷，降低腦癱的發生率，故對于腦損傷患兒要早診斷、早干預。

馬丙祥等提出“痰”和“瘀”是腦損傷的主要病理因素，進行了相關動物實驗，認為一氧化氮合酶、血小板活化因子、TNF-α、IL-6等可能是腦損傷“痰”“瘀”的本質[13-15]。因腦癱患兒多有早產、宮內發育遲緩、宮內感染等胎兒期疾病史，考慮其存在先天稟賦不足，先天之精不能充養腦髓及五臟六腑、四肢百骸，經脈氣血運行無力，正氣不足，故易被胎內邪氣所侵染，由虛致瘀，痰飲、瘀血生之。而“痰飲、瘀血”等病理產物的留存，損傷腦髓、臟腑的同時，更加重了經絡阻滯不通，不能正常輸布先天、后天之精氣，使患兒日益虛損，形成了惡性循環。基于此，我們提出了“臟腑失調，腦髓失養”是腦癱發生的重要中醫病理機制。如何能在改善腦癱患兒臨床癥狀的同時，提高患兒體質，使對腦癱患兒的治療能夠步入日益好轉的良性循環，是目前臨床亟需解決的問題。在此，我們嘗試運用“調節臟腑，充養腦髓”之法，取俞募配穴進行針刺治療腦癱患兒，以期能夠在一定程度上解決上述問題。

腦癱中醫病位在腦，但與心、肝、脾、腎等臟腑都有密切的聯系，俞募穴主要分布于任脈、胃經、肝經、膀胱經。因此，從中醫學理論上來說針刺俞募穴具有治療腦部疾患的作用。心主神明，《素問·靈蘭秘典論》謂：“心者，君主之官也，神明出焉”，《本草綱目·辛夷·發明》載“腦為元神之府”，腎主骨生髓，髓通于腦，“諸髓者，皆屬于腦”，“腦為心之使”，“腎氣上通與腦”，可見腦與心腎關系密切。針刺心腎俞募穴可補腎生髓，開心竅，醒神智，促進腦的發育，提高患兒智力。心開竅于舌，針刺心臟俞募穴不僅可以提高患兒智力，亦可以促進其語言功能的發育，心與小腸相表里，針刺小腸募穴關元具有同樣的治療效果。腎開竅于耳，針刺腎臟的俞募穴可以改善患兒追聽差、反應不靈敏的情況，腎與膀胱相表里，針刺膀胱經募穴中極亦可起到相應的治療效果。故俞募配穴針刺療法具有應用于腦病治療的理論基礎[16]。通過相關臨床研究發現，俞募穴速刺法在促進腦癱患兒腦發育粗大運動功能、體格生長、減少感染次數和提高智力水平等方面均取得顯著療效[17-18]。

本實驗結果表明應用俞募穴速刺法可下調宮內感染/炎癥所致早產腦損傷大鼠IL-6和TNF-α的表達，提示俞募穴速刺治療腦損傷的機制可能是通過調節腦組織炎性因子水平，產生神經保護作用，從而避免或減輕腦室旁白質軟化的進展。且研究發現腦損傷早期應用俞募穴速刺對于炎性因子的調節作用優于晚期應用，長療程應用效果優于短期應用。本實驗為俞募穴速刺法的進一步臨床推廣應用奠定了實驗基礎，對于治療宮內感染/炎癥所致的早產腦損傷并改善預后具有重要的意義，提倡早期、長療程應用。在臨床的治療中，俞募穴速刺法充分體現了中醫治療的特色與優勢，其不僅可以促進腦損傷患兒的康復，且痛苦小，更容易被患兒及家長接受，值得我們在臨床推廣應用。