基于培養基壓力控制的組織工程化生物膜動態培養系統的研究

趙艷媛 顏黃蘋 陳延平 曾少軍 殷皓

組織工程技術主要采用細胞和生物材料共同構建與正常組織結構功能相近的復合物來修復缺損[1]。生物膜的組織工程化研究是當前的熱點方向之一。組織工程化生物膜研究的主要是生物體各器官中的膜結構，如組織工程化角膜、組織工程化黏膜、組織工程化滑膜等。

以往的組織工程化生物膜培養技術多為靜態培養，由人工操作，易導致構建的組織工程化生物膜被污染。近年來，生物膜動態培養技術的研究不斷深入。在組織工程化角膜研究方面，Tsai等[2]以羊膜為載體，進行角膜上皮組織培養，患者移植后取得了較好的療效。Fan等[3]用貼膜培養法與時間梯度連續揭膜法，成功建立人生物膜內皮細胞系。王丹等[4]用全生物膜組織培養法成功得到純度高、產量多的生物膜成纖維細胞。針對組織工程化黏膜的研究中，Rouabhia等[5]以口腔上皮細胞和成纖維細胞為種子細胞成功構建黏膜，其上皮層分層良好，固有層也有大量的成纖維細胞聚集。Fukahori等[6]利用組織工程化黏膜成功修復了比格犬的聲帶黏膜缺損。組織工程小腸黏膜下層已被應用于血管、膀胱壁、腹壁、肌壁及神經等多種組織的缺損修補[7]。在組織工程化滑膜的研究中，李穎杰等[8]構建了能模擬滑膜襯里層的多層結構細胞層。王麗平等[9]采用組織塊貼壁法成功分離培養了佐劑性關節炎兔成纖維樣滑膜細胞。孫貴才等[10]的研究證實，組織剪碎不加消化酶人工貼壁培養法進行鼠膝關節滑膜細胞體外培養，能培養出具有最強大活力的細胞。

這些動態培養技術的培養條件難以控制，導致生物膜形態、質量難以標準化，且固定條件下培養的生物膜無法滿足臨床個性化治療的需求。研究發現，培養皿中培養基的壓力與生物膜的培養具有密切聯系[11-15]。陸曉娜等[14]設計了可為軟骨組織提供循環可控動態力學刺激的組織工程培養儀；陶蒙設計開發的儀器可通過旋轉培養軸來改變力學環境，以實現角膜的動態培養[15]。但這些調整壓力的方式較為復雜，不易操作，且有污染培養基的可能。因此，我們嘗試設計一種組織工程化生物膜動態培養系統，通過控制培養皿中培養基的壓力，來為生物膜組織工程培養提供可控的動態力學環境，以適合不同患者對生物膜的需求。

1 培養基壓力控制原理

研究表明，力學環境對于組織工程化生物膜的培養有重要影響，一定的力學刺激可促進細胞的增殖與遷移，有利于生物膜組織的修復[11-15]。

由帕斯卡定律可知，液體中任一點壓力為F=ρgV（式 1）[16]。 其中，F 為液體中任一點的壓力；ρ 為液體密度；g為重力常數；V為液體總體積。

在一圓柱形容器中，設兩處連通口，進液口s0和出液口s1（圖1）。經推算，該容器中任一點壓力為F=ρghs+ρgv0t(s0-s1)（式 2）。 其中，h 為容器高度；s為容器底面積；s0為容器進液口截面積；s1為容器出液口截面積；v0為液體流速；t為單位時間。

圖1 容器結構示意圖Fig.1 Schematic diagram of culture dish structure

由式（2）可知，容器內任一點的壓力與進液口截面積和出液口截面積之差成正比，控制進液口截面積或出液口截面積即可改變其壓力值。因此，本文據此原理設計一種基于培養基壓力控制的組織工程化生物膜動態培養系統。

2 基于培養基壓力控制的組織工程化生物膜動態培養系統

我們提出的基于培養基壓力控制的組織工程化生物膜動態培養系統，主要由培養皿、蠕動泵、壓力控制模塊、主控器與檢測模塊等組成（圖2）。組織工程化生物膜放置于培養皿內，蠕動泵啟動后，培養基充滿培養皿并在培養過程中不斷循環；通過主控器設置生物膜組織培養的時間、培養基壓力值，然后系統開始運行，監測模塊實時采集培養基的壓力值數據，將數據傳輸至主控器，主控器根據壓力值數據進行判斷，命令壓力控制模塊相應地調整培養基的壓力值；以上過程循環進行，直至培養結束。

2.1 培養皿

培養皿作為生物膜組織細胞生長增殖最直接的環境，培養基在此循環，提供細胞生長所需營養。傳統的培養皿為圓盤狀培養皿或瓶狀培養皿[17-18]，固定組織操作不便，培養基不能循環，無法檢測培養基壓力。因此，本研究設計了一種新型的培養皿 （圖3），是空心圓柱形器皿，為培養基存儲與循環的主要空間，在培養皿壁上開3個通孔，分別作為進液口、出液口及監測口。生物膜組織放置于固定平臺，用帶有橡膠圈的卡扣式圓環固定，當培養基充滿培養皿時便與之接觸，并隨培養皿內培養基體積的變化鼓起或收縮。監測模塊中的壓力傳感器通過監測口接觸培養皿內的培養基，監測其壓力值。該培養皿密封性好，操作簡單，可有效防止材料污染，便于觀察生物膜培養狀態及壓力檢測與控制。

2.2 蠕動泵與壓力控制模塊

蠕動泵為驅使培養基流動與循環的裝置，培養基被隔離在泵管中，可快速更換泵管與消毒，避免發生污染，并可保持培養基流速。

我們利用壓力控制模塊，保持培養皿進液口截面積s0不變，通過改變出液口截面積s1以控制培養皿內培養基壓力。其中，液體密度ρ與重力加速度g為常數。培養基壓力控制模塊位于培養皿出液口處，用于控制培養基壓力。該壓力控制模塊中使用步進電機驅動兩擋板擠壓出液口連接軟管，改變軟管的截面積，即出液口截面積，從而控制培養皿內培養基的壓力；而電機的動作由主控器發送至電機驅動器的命令決定。

2.3 主控器與監測模塊

生物膜動態培養系統主控器為STM32F103單片機，外接觸摸屏作為用戶操作界面。監測模塊使用SM5852－008壓力傳感器，經培養皿檢測口與培養基接觸獲得壓力值。可在操作界面設置生物膜組織培養的時間與培養基壓力值，控制器根據監測模塊傳來的數據進行判斷，發送指令至壓力控制模塊，壓力控制模塊執行相應的操作，以保證生物膜的動態培養。

該培養系統軟件部分的主流程為初始化、設置、運行、結束4個步驟。系統初始化后，可設置生物膜組織培養的時間、培養基壓力值，系統開始運行（圖4），結合（式3）算法使系統自動運行直至結束。

圖4 系統運行程序流程圖Fig.4 Flow chart of system running program

3 實驗與測試

運行該基于培養基壓力控制的組織工程化生物膜動態培養系統，主控器驅動壓力控制模塊逐步改變出液口截面積，檢測模塊讀取相應的培養基壓力值，可獲得出液口截面積與培養基壓力值的關系曲線（圖 5）。

重復實驗并進行曲線擬合后可得出液口截面積與培養基壓力值S曲線擬合曲線（圖5），其關系式即（式 3）。

圖5 實測出液口截面積與培養基壓力值關系曲線及其S曲線擬合曲線Fig.5 Relation curve between the output area and the pressure value.Solid line for measured curve and dashed line for S curve fitting curve

在該系統運行過程中，主控器根據設定的壓力值通過（式3）算法可迅速將壓力值調整至設定值附近，再通過運行程序流程圖細調便可使培養基壓力值達到設定值。

結果顯示，本研究提出的基于培養基壓力控制的組織工程化生物膜動態培養系統，可控制培養基壓力范圍為0.12～19.76 mmHg，并可使其保持在某一固定值。一般地，正常眼壓為 10～21 mmHg[19]，正常顱內壓為7～11 mmHg[20]，該系統可滿足在此壓力環境內生物膜的培養要求。

4 結論

本研究提出的基于培養基壓力控制的組織工程化生物膜動態培養系統，包括培養皿、蠕動泵、壓力控制模塊、主控器與檢測模塊等部分，可實現培養基壓力在0.12～19.76 mmHg范圍內的控制，可提供此壓力范圍內生物膜培養所需的壓力環境。與傳統的生物膜培養系統相比，該系統使培養更具可控性，標準化，使培養的生物膜可適應不同患者的需求，有利于進一步的臨床治療與研究。對于該系統的研究，下一步應投入實際的生物膜培養實驗，研究生物膜的培養狀況，進一步完善該系統。