發光細菌毒性檢測機理及應用研究進展

胡欣穎 賀稚非 李洪軍

(1. 西南大學食品科學學院，重慶 400715；2. 重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶 400715)

隨著食品行業的發展，食品分析技術的作用日趨重要。應用化學分析方法，如原子吸收光譜法(atomic absorption spectroscopy，AAS)、氣相色譜法(gas chromatography，GC)、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)以及各種聯用方法如氣質聯用(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)等，檢測食品中有毒有害物質，但前處理過程繁雜、需要專業操作人員、分析步驟繁瑣、設備昂貴[1-2]，并且受限于實驗室使用，無法在食品生產與流通過程中實現有毒有害物質的實時檢測。最主要的是這些技術雖然能檢測化合物濃度，但不能反映有關樣品的毒性[3]。生物學檢測方法不僅可以估計樣本毒性，還可以估計毒物對整個生態系統的綜合影響[4]。經典生物測定通常使用小鼠、魚類、藻類、甲殼類動物、植物或其他生物體[5]，但也存在缺點：需要特殊設備和專業操作人員，測定時間長、重現性低以及存在生物標準化爭議[5-7]。因此尋找一種簡單、快速且便宜的生物檢測方法成為迫切的需求。

發光細菌是一類在正常代謝過程會發光的生物。自1969年Kossler闡述了基于生物發光細菌的生物測定法后[8]，發光細菌逐漸被用于各種環境污染物監測和食品單一及綜合毒性評價。同時構建了以發光細菌發光強度變化為指標的有害物質檢測標準，相關的檢測試劑盒也陸續研制成功[9]。相較于化學檢測，發光細菌檢測具有前處理簡單，反應快、靈敏度高、可實時監測，成本低、樣品需求量少、實驗室及耗材需求低等優點[10-11]，將成為食品安全檢測新的發展方向，目前中國關于發光細菌檢測的研究相對較少，缺乏對發光細菌在毒性評估和食品有毒有害物質檢測方面的系統性分析和總結。

基于此，本文綜述發光細菌在毒性評估及食品安全檢測中的應用，對發光細菌檢測存在的問題及未來的發展方向進行分析和總結，以期對發光細菌在食品有毒有害物質檢測中的應用和新型檢測儀器的開發提供理論依據。

1 發光細菌檢測有毒有害物質的機理

1.1 發光細菌簡介

生物發光是一種常見的現象，絕大多數生物發光有機體生活在海洋中，只有少數生活在陸地或淡水環境中。發光細菌是一類能夠在正常代謝過程中發出藍綠色光的生物，全部是革蘭氏陰性菌，其大多為直桿菌，也有少數呈弧狀或球桿狀，有鞭毛。發光細菌個體微小，長度約為1.5～3.0 μm，寬度約為0.5～0.8 μm，釋放的藍綠色熒光波長范圍為450～490 nm[12]。單個發光細菌發出的光極其微弱，肉眼幾乎不可見，但當大量發光細菌聚集在一起時，發出的光則肉眼可見。

發光細菌屬于變形菌門、γ變形菌綱。發光細菌可分為4個屬：光桿菌屬(Phototrhabdus)、發光桿菌屬(Photobacterium)、希瓦氏菌屬(Shewanella)和弧菌屬(Vibrio)[12-13]。光桿菌屬的典型菌有陸地發光桿菌(P.luminescens)、溫和光桿菌(P.temperate)等，發光桿菌屬的典型菌有明亮發光桿菌(P.phosphoreum)、鰒魚發光桿菌(P.leiognathi)、夾孢發光桿菌(P.angustum)等，希瓦氏菌屬的典型菌有羽田希瓦氏菌(S.hanedai)等，弧菌屬的典型菌有哈維氏弧菌(V.harveyi)、費氏弧菌(V.fischeri)、青?；【?V.qinghaiensis)、霍亂弧菌(V.cholerae)等。

1.2 發光細菌檢測機理

發光細菌中分子氧以還原態的黃素單核苷酸(FMNH2)及長鏈脂肪醛(RCHO)為底物，經胞內細菌熒光酶催化作用，將二者分別氧化為黃素核苷酸(FMN)和長鏈脂肪酸，同時伴隨著波長為450～490 nm藍綠光的釋放，可以通過生物發光計檢測。

在發光細菌中廣泛存在表達熒光素基因(lux)。lux基因主要包括luxC、luxD、luxA、luxB、luxE 5個部分，其中luxA、luxB編碼熒光素酶[14]，該酶是一種分子量為80 kDa的異二聚體蛋白，包括α(40～42 kDa)和β(36～37.5 kDa)2個亞基[15]，在其發光過程對FMNH2具有高度的特異性。luxC、luxD、luxE分別編碼酰基蛋白還原酶(R，54 kDa)、?；D移酶(t，33 kDa)和依賴ATP的合成酶(S，42 kDa)，這3種酶能夠組成脂肪酸還原酶復合體催化醛類(該反應中參與發光的醛可能是十四醛)生成，使細菌持續發光[16]。海洋發光細菌，如明亮發光桿菌(P.phosphoreum)、鰒魚發光桿菌(P.leiognathi)、哈維氏菌(V.harveyi)、費氏弧菌(V.fischeri)等，在luxE之后還有一個額外的基因luxG，有研究者[17]推測luxG基因產物是為螢光素酶反應提供FMNH-底物的黃素還原酶。發光細菌生物發光機理見圖1[9]。

圖1 發光細菌生物發光機理Figure 1 Luminescent bacteria bioluminescence mechanism

發光細菌檢測機理分為特異性檢測和非特異性檢測，特異性發光細菌檢測是根據受體-報告基因的原理(“lights on”模式)[18]，在lux上游導入特殊應激啟動子，當宿主細胞的生長環境中有毒物存在時，毒物進入到宿主細胞，誘導特異性調控元件，進而調控下游基因表達，發出光源。非特異性檢測利用的原理是發光細菌“lights off”模式[19-20]，即外來毒物通過直接抑制發光細菌酶的活性以及抑制細胞內有關發光反應的生理代謝對發光細菌形成發光抑制作用，見圖2[19]。在“lights on”測定中，可定量的報道分子與已知的被測目標毒物活化的特定基因啟動子融合，改變發光強度。在“lights off”測定中，樣品毒性根據正常細胞活性的抑制程度估算，這種抑制可以發生在反應的任何階段或影響細胞生長發育的任何位點。生物發光廣泛依賴于細胞代謝，需要高能輔因子，因此，當接觸到外界有毒有害物質時，發光細菌新陳代謝受到影響，進而使發光強度減小[21-22]。

圖2 發光細菌檢測有害物質原理Figure 2 The principle of detecting harmful substances by luminescent bacteria

2 發光細菌在毒性評估中的研究現狀

2.1 利用發光細菌檢測與傳統急性毒性檢測方法對比

生物毒性是指外源性物質與機體接觸或進入機體后對機體產生的損傷，有急性毒性和慢性毒性2種。在應用發光細菌對毒物進行生物毒性評價時，發光細菌因在毒物中暴露時間較短，通常被認為是一種急性毒性評估。急性毒性的測試是毒理學安全性評價的基礎性試驗，是制訂衛生管理標準不可或缺的依據[23]。隨著急性毒性評價方法的不斷發展，當前中國的急性毒性試驗主要采用傳統方法(GB 15193. 3—2003)[24]。但由于使用動物數量較大且LD50的測試受動物及實驗室環境的影響，在“3Rs”原則，即減少(reduction)、優化(refinement)、替代(replacement)[25]下，衍生出了固定劑量法(fixed dose procedure，FDP)、急性毒性分類法(acute toxic class method，ATC)、上下法(up-and-down procedure，UDP)等方法，旨在采取其他措施來減少試驗中動物的痛苦，這3種方法是目前常用的方法。其與利用發光細菌檢測相比優缺點見表1[10,21,26-27]。

表1 急性毒性評估中傳統方法和發光細菌檢測方法的優缺點Table 1 Advantages and disadvantages of traditional methods and luminescent bacteria detection methods in acute toxicity assessment

2.2 發光細菌在毒性評估中的應用

細菌發光在毒理學中的應用從發光細菌應用于生態監測開始，目前仍被廣泛地應用，關于發光菌在毒性評估中的研究與應用主要集中在環境科學的各個領域[28-29]。在食品行業，可見報道主要集中在發光細菌用于食品添加劑、農藥和獸藥的毒性評價。Cai等[30]研究了5種典型的農藥(樂果、馬拉硫磷、阿特拉津、滅草靈、乙草胺)對發光細菌的毒性作用及其作用機制。石穎等[31]分別用8種獸藥作用于青海弧菌Q67，發現Q67的相對發光率與獸藥濃度呈反比，并總結了8種獸藥的抑制效率。

這些研究多集中在對單一物質的毒性評價，但在實際的檢測應用中，食品成分具有復雜性，化學混合物的毒性具有聯合作用，如拮抗作用、協同作用或加和效應等，發光細菌會受多種有毒物質的影響。因此，研究混合毒物對發光細菌的毒性作用具有重要的意義?；诖?，吳淑杭[32]以青?；【①M氏弧菌和明亮發光桿菌T3為受試對象，研究重金屬、農藥和獸藥等農產品污染物的單一毒性和聯合毒性，揭示多種污染物共存時產生的毒性聯合作用與綜合生物毒性，并建立專用數學模型。

在聯合毒性的研究中，選擇合適的聯合毒性評價模型進行毒性評價非常重要，常用的聯合毒性評價方法有指數法、濃度加和與獨立作用模型(CA/IA)法以及定量結構-活性關系模型(QSAR模型)預測法[33-34]。3種毒性評價方法各有優劣，在應用過程中應根據實際情況進行選擇。目前關于這些模型在發光細菌中的應用也有諸多報道，張瑾等[35]以青?；【鶴67為受試微生物，測定6種吡啶類離子溶液組成的4組二元混合物和2組三元混合物的聯合毒性，用濃度加和模型進行分析，結果表明：除了有一組主要是拮抗作用外，其他組都是加和作用。董玉瑛等[36]測定了3種醫藥成分：阿奇霉素、鹽酸環丙沙星和阿司匹林組成的混合體系對發光細菌的聯合毒性，應用多種方法進行評價，得出的結果具有一致性，說明這些評價方法在聯合毒性中具有可行性。

3 發光細菌在食品安全檢測中的應用

3.1 發光細菌應用現狀

表2顯示了國內外學者利用發光細菌在部分食品安全檢測中的應用。由表2可知，目前國內外的研究重點主要集中在以天然發光細菌為代表的非特異性發光細菌的應用上。在食品原料選擇上，以農畜產品居多，比如蔬菜、肉類、奶類，很少涉及其他食品種類。而且在農畜產品中以畜產品為原料的研究最多，在檢測毒物種類上，主要集中在對農獸藥，尤其是對獸藥進行檢測，而對食品添加劑、食品中的生物毒素以及其他有毒有害物質的檢測較少，并且在獸藥檢測中，很少涉及一些激素類獸藥如糖皮質激素等的檢測研究。

在發光細菌的選擇方面，以青?；【鸀榇淼牡l光細菌逐漸成為研究的熱門。因為與海洋發光細菌相比，青?；【跈z測時不需要保證2%～3%的氯化鈉濃度，避免了NaCl對樣品特性的干擾。

在特異性發光細菌研究應用方面，目前在食品科學領域的研究報道較少，大多集中在四環素類抗生素以及少量關于β-內酰胺類藥物的研究上。盡管特異性工程細菌在食品科學領域的研究應用剛剛起步，但其在環境科學中已有深入研究，已經建立了對多種重金屬能夠特異性檢測的工程菌[46]。這些研究可以為發光細菌在食品安全檢測中的應用提供借鑒。

3.2 檢測效果的影響因素

發光細菌是一種生物檢測技術，發光細菌本身具有不確定性，且樣品的組成具有復雜性。因此在實際檢測過程中，檢測效果會受到多種因素的影響，如原料前處理、毒物興奮效應、樣品刺激作用等。

3.2.1 原料前處理 在食品安全檢測中，樣品前處理占據整個樣品分析的大部分時間，并且檢測結果的重復性、準確性以及方法的靈敏度都與樣品前處理過程密切相關。理想的原料預處理方法，不僅能獲得待檢測物質，還能夠減少對發光細菌檢測的干擾。目前，在樣品前處理中常用的方法有溶劑萃取法和離心法。在國內外的一些研究中，都是將原料絞碎、離心，然后取上清液備用[41,47-48]，但這些方法均存在提取不徹底的缺點，這使發光細菌檢測技術不能準確地反映被檢樣品的毒性。并且在用有機溶劑萃取時，有機溶劑也可能會對發光細菌發光強度造成影響。因此，Pellinen等[40]在檢測魚肉中四環素時，對處理魚肉樣品的方法進行了優化，在均質之后不進行離心，也不使用有機溶劑，優化后的方案可使四環素的檢出限更低。

表2 國內外學者在食品安全檢測中應用發光細菌的部分研究Table 2 The application of luminescent bacteria in food safety detection

在利用發光細菌進行快速檢測時，無色或顏色較淺的液體樣品比較容易測試，而固體樣品則必須經過前期處理才能進行檢測。在固體樣品的預處理方面，一些適用于其他生物檢測的預處理方法如固相萃取[49]等，也適用于發光細菌檢測。

3.2.2 毒物興奮效應 毒物興奮效應(Hormesis)是一種生物體的適應性反應，它是指在致毒因素不同的劑量強度范圍，生物體具有不同的劑量—反應關系[50]。Hormesis通常被認為是毒物對生物體在高劑量時表現負面影響(如生長發育受到抑制)，但在低劑量時卻表現為有益作用(如刺激生長發育)[51]，其主要應用于遺傳毒性致癌物健康風險評估與毒物生態風險評估上。大多數農、獸藥都顯示出毒物興奮效應，Calabrese等[51]指出青霉素、鏈霉素、土霉素、氯霉素、硫藤黃菌素、抗金葡美蘇、磺胺、桿菌肽、吡啶硫胺素等藥物在低劑量下能夠刺激生物體生長；Morse[52]認為需要考慮農藥的Hormesis，從而完整了解農藥的潛在影響。

在發光細菌毒性評估中，也會出現毒物興奮效應。湯淼等[53]以費氏弧菌作為受試生物，鹽酸四環素作為研究對象，證明了在細菌生長的延滯期和平臺期，鹽酸四環素對費氏弧菌的發光強度存在時間依賴型毒物興奮效應。Shen等[54]通過建立劑量—效應曲線和時間—效應曲線研究了Cu、Zn、Cd、Cr對青?；【挠绊?，并發現4種金屬對青?；【哂忻黠@的毒物興奮效應。

3.2.3 樣品刺激作用 在利用發光細菌進行毒性評估和食品安全檢測時，樣品中的某些非研究對象也會引起發光細菌發光強度的變化。已有的研究表明，低劑量的K+、Ca2+、Na+等無機離子均對天然發光細菌產生刺激作用[53]，并且這種刺激作用在淡水重組菌中并未出現減弱現象[55]。

樣品的刺激作用具有兩面性，在海洋發光細菌利用過程中，需要2%～3%的NaCl溶液來模仿海洋環境，并用其處理樣品，溶液中的KCl、NaCl等無機物會對發光細菌產生刺激作用，在毒性測試中使發光細菌保持最大發光強度。但是這種鹽溶液有可能會改變樣品性質，如降低金屬的生物利用率和有機物的溶解性[56]，這都會使檢測誤差偏大。

4 結論與展望

發光細菌繁殖速度快，易于培養和觀察，這為其在檢測中的應用提供了一個廣闊的發展空間。發光細菌檢測方便快捷且成本低，雖然在環境科學領域已經取得長足的發展，但在食品科學領域，尤其是在食品安全檢測中的研究與應用起步較晚，其前期研究主要停留在整體水平以及細胞水平，目前正向基因水平和分子水平的方向縱深發展。因此，在食品領域，對發光細菌展望如下：

(1) 發光細菌在食品安全檢測中的應用研究范圍需要擴大，不應僅僅停留在農畜產品檢測方面，應拓寬至其他深加工食品中；并且被檢測物質應包含農藥殘留、獸藥殘留、食品添加劑以及生物毒素等有毒有害物質，全方位地確保食品安全。

(2) 在諸多限制發光細菌檢測發展的因素中，原料前處理方式、毒物興奮效應以及樣品自身的刺激作用是制約該方法發展的主要因素，應尋求合理的解決方式減少這些影響。

(3) 在特異性發光細菌研究方面，應積極借鑒其他領域的成功經驗，構建出在食品有毒有害物質檢測中能實現特異性檢測的發光細菌。

(4) 在熱門發光細菌青?；【难芯糠矫?，應對發光機理及毒物興奮效應進行系統研究，從而為其在食品安全檢測中的應用提供理論依據。

(5) 制定關于發光細菌在食品行業使用的統一標準，現在可作為參考的只有GB/T 15441—1995，發光細菌的研究取得了很大進展，如發光細菌凍干粉、發光細菌固體培養試劑盒以及發光細菌毒性檢測儀的商業化。因此，急需完善相關的標準政策，以推動該產業的健康快速發展。