6種食用花卉有效成分及其抗氧化活性研究

張東峰 劉 琪 張欣悅 付鑫景 張佳琦 陸 俊,3

(1. 廣東輕工職業技術學院食品與生物工程系，廣東 廣州 510300；2. 中南林業科技大學食品科學與工程學院， 湖南 長沙 410004；3. 特醫食品加工湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410004)

食用花卉是指能夠直接利用花朵或花的葉食用的植物[1]。近年來，國內外對食用花卉的現狀與前景已有一定的研究[2]，現證實，食用花卉中含有96種可供人體吸收的物質，包括多種營養素、活性蛋白酶和多酚化合物等活性物質[3-4]，其中多酚主要有酚酸、黃酮和花色苷[5-6]等。食用花卉萬壽菊，具有祛風降火，化痰止咳，平肝清熱的功效，其主要酚酸類物質包括原兒茶素、綠原酸、沒食子酸和阿魏酸[7]。 Kaisoon等[7]通過FRAP法對泰國的12種花卉進行研究，測得萬壽菊具有最高的三價鐵還原抗氧化能力。Sugawara等[8]發現菊類中木犀草素-7-O-(6′-O-丙二酰胺)-葡萄糖苷具有很強的抗清除自由基的能力，其他的黃酮類化合物如芹菜素、綠原酸、3，5-雙咖啡酰基奎寧酸等也具有很好的抗氧化活性。桂花也是一種常見的食用花卉，熊麗娜[9]18測得桂花黃酮總量為179.03 mg 蘆丁/g ·DW，桂花多酚的抗氧化能力為1 476.5 μmol TE/g ·DW，證明其有較強的抗氧化能力。木芙蓉、桅子和木槿等食用花卉亦具有清熱利濕、益胃生津、抗炎和涼血止血等功效[10-11]，但對它們抗氧化活性的綜合比較卻鮮見報道，對其具體多酚類化合物組分的研究更是匱乏。因此，本研究通過3種體外抗氧化方法(ABTS、FRAP、DPPH)，對木槿、梔子、桂花、木芙蓉、黃色萬壽菊和橙色萬壽菊6種食用花卉的抗氧化活性能力進行測定，并通過HPLC測定6種食用花卉的多酚類化合物，比較各食用花卉的抗氧化能力差異性及其與物質基礎的相關性。為食用花卉的開發利用提供進一步的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

木槿(HibiscussyriacusLinn.)、梔子(GardeniajasminoidesEllis)、桂花[osmanthusfragrans(Thunb.) Lour.]、木芙蓉(HibiscusmutabilisL.)、黃色萬壽菊[TageteserectaL. (Yellow)]、橙色萬壽菊[TageteserectaL. (Orange) ]：2016年7～10月采摘于中南林業科技大學長沙校區；

2，4，6-三吡啶基三嗪(TPTZ)：分析純，都萊生物技術有限公司；

水溶性維生素E(Trolox)：分析純，華藍化學有限公司；

2，2′-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)：分析純，合肥博美生物有限公司；

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：分析純，日本TCI公司；

其它試劑均為國產分析純；

沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、兒茶素、阿魏酸、槲皮素、芹菜素、山奈酚：色譜純，成都曼思特生物科技公司。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜：LC-20A型，日本島津有限公司；

紫外可見光光度計：UV1800型，日本島津有限公司；

超聲波細胞粉碎機：JY 92-IIN型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

高速多功能粉碎機：JP-150A-8型，永康式久品工貿有限公司；

快速混勻儀：SK-E型，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品溶液的制備 陰干花卉在40 ℃的烘箱內干燥5 h，磨粉后過40目篩。稱取2 g花粉，加入濃度為75%的乙醇30 mL，在40 ℃，80 W的條件下超聲波提取40 min。再用旋轉蒸發儀減壓濃縮30 min待用。

1.3.2 多酚的測定 采用福林-酚試劑比色法[12]，多酚含量以每克樣品中沒食子酸毫克當量表示(mg GAE/g· DW)。

1.3.3 黃酮的測定 采用亞硝酸鈉-氯化鋁法[13]，黃酮含量以每克樣品中兒茶素毫克當量表示(mg CE/g· DW)。

1.3.4 花色苷的測定 參照Loizzo等[14]的pH示差法并略作修改，將1 mL提取物(1 g/15 mL 75%乙醇溶液)與49 mL 氯化鉀緩沖液(0.025 mol/L，pH 1)[或49 mL乙酸鈉緩沖液(0.025 mol/L，pH 4.5)]混合。10 min后，在510，700 nm測量每種溶液的原始吸光度。 吸光度差異計算如下：A=[(A510-A700)pH1.0-(A510-A700)pH4.5]。 使用矢車菊-3-葡萄糖苷(ε=26 900 L/(mol·cm)，MW=449.2 g/mol)的摩爾吸光系數(ε)和分子量(MW)按式(1)計算花色苷含量。

(1)

式中：

C——花色苷含量，mg CyA/g· DW；

A——吸光度差異值；

MW——矢車菊-3-葡萄糖苷的分子量，g/mol；

DF——稀釋倍數；

l——光路長，cm；

ε——矢車菊-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數，L/(mol·cm)；

1 000——轉換系數；

V——樣品提取液的體積，L；

m——樣品的重量，g。

1.3.5 類胡蘿卜素的測定 采用比色法，參考文獻[15]修改如下：取樣品提取液加蒸餾水稀釋1～5倍后在440 nm處測定樣品的吸光度，同時用蒸餾水作空白對照。類胡蘿卜素含量按式(2)計算:

(2)

式中：

C——類胡蘿卜素含量，mg/ g· DW；

A——吸光度；

20——換算系數；

DF——稀釋因子；

V——提取液體積，L；

m——被測食用花卉的質量，g。

1.3.6 DPPH抗氧化活性的測定 參考Gorjanovic等[16]的方法，抗氧化能力用每克樣品中Trolox微摩爾當量表示(μmol TE/g ·DW)。

1.3.7 FRAP抗氧化活性的測定 參照Lu等[17]的方法，抗氧化能力用每克樣品中Trolox微摩爾當量表示(μmol TE/g ·DW)。

1.3.8 ABTS抗氧化活性的測定 參照Oh等[18]的方法，抗氧化能力用每克樣品中Trolox微摩爾當量表示(μmol TE/g ·DW)。

1.3.9 高效液相色譜法測定 參考Kaisoon等[7]、張倩倩等[19]的方法并進行適當優化。使用島津LC-20A型高效液相系統，配備有二極管(PDA)陣列檢測器進行梯度洗脫，樣品過0.45 μm膜。色譜柱：CNW Athena C18-WP(4.6 mm×250 mm，5 μm)。流動相A為乙酸(pH 2.74)、流動相B為乙腈，設定0.8 mL/min流速。梯度洗脫進行：0～5 min，5%～9% B；5～12 min，9%～12% B；12～17 min，12%～18% B；17～21 min，18% B；21～28 min，18%～22% B；28～43 min，22%～70% B；43～55 min，70%～90% B；55～60 min，90%～5% B，最后用5% B再平衡5 min，柱溫度38 ℃，檢測波長280 nm，進樣體積10 μL。各標準品溶液和樣品過0.45 μm膜，采用外標法得到標準曲線方程。

2 結果與分析

2.1 酚類化合物標準曲線

各標樣線性范圍、回歸方程、LOD、LOQ見表1。

2.2 6種食用花卉的抗氧化活性成分

通過HPLC對6種食用花卉中的具體活性成分進行檢測，結果見圖1和表2，由表2可知，6種花卉抗氧化活性成分的種類和含量有較大差異。如花色苷只在桅子花和芙蓉花檢測到；沒食子酸只在桅子花、桂花、黃色萬壽菊、橙色萬壽菊中檢測到；綠原酸、咖啡酸、芹菜素分別只在木槿花、桂花和木槿花中檢測到；阿魏酸除了芙蓉花，其他花卉中都能檢測到，6種食用花卉都檢測到的活性成分為類胡蘿卜素、槲皮素和山奈酚。6種花卉中，多酚含量最多的為黃色萬壽菊，其次為橙色萬色壽菊，最少的為木槿花；黃酮含量最多的為黃色萬壽菊，其次為桂花，最少的也為木槿花。黃帥等[20]研究表明萬壽菊中存在類胡蘿卜素、沒食子酸、槲皮素等成分，本研究結果除這些成分外，還從中檢測到了阿魏酸和山奈酚等活性成分。苗苗等[21]測得萬壽菊黃酮含量為121.4 mg/g· DW，均低于本試驗測得的2種萬壽菊總黃酮含量。本試驗測得的桂花總黃酮含量與2種萬壽菊較接近，為(176.16±1.24) mg RT/g·DW，與熊麗娜[9]18測得桂花黃酮總量(179.03 mg/g·DW)結果相近。尹偉等[22]研究表明桂花中含有綠原酸、咖啡酸、山奈酚、槲皮素等化合物，本試驗中未檢出綠原酸，但檢出了咖啡酸、山奈酚、槲皮素、阿魏酸和沒食子酸。宋家玲等[23]利用各種波普技術鑒定出梔子花中存在山奈酚、槲皮素、β-胡蘿卜苷等15種化合物，同樣在本試驗中，從桅子花中也檢測到了山奈酚、槲皮素，此外還有阿魏酸和沒食子酸；李軍茂等[24]利用超高效液相色譜與飛行時間質譜聯用(UHPLC-Q-TOF-MS/MS) 技術鑒定木芙蓉中包含蘆丁、山奈酚、槲皮素等化合物，蔣益花等[25]利用微波技術進行正交試驗，測得木芙蓉中黃酮含量為31.78 mg/g ·DW，與本試驗接近。 衛強等[26]在木槿的乙醇提取物中鑒定出β-胡蘿卜苷、山奈酚、芹菜素等化合物，張文彥等[27]測得木槿花中總黃酮含量為6.01 mg/g·DW，低于本試驗的12.52 mg/g·DW。6種花卉中抗氧化活性成分總量的排名為：橙色萬壽菊>黃色萬壽菊>梔子花>桂花>芙蓉花>木槿花。6種常見花卉中所含多酚、黃酮及其他活性成分與已有研究存在一定差異，可能與花卉活性成分的提取方法、試驗條件及花卉的地區不同有一定關系。

表1 8種酚類化合物回歸方程、相關系數和線性檢測范圍Table 1 Linear regression equation, correlation coefficient and linearity of eight reference standards

表2 6種食用花卉抗氧化活性成分?Table 2 Antioxidant active ingredient of six kinds of edible flowers

? 同一列不同小寫字母表示數值間差異顯著(P<0.05)；nd表示該物質在樣品中未檢測到或濃度低于檢測限，*總量為除多酚和黃酮之外的其他成分之和。

1. 沒食子酸 2. 綠原酸 3. 咖啡酸 4. 兒茶素 5. 阿魏酸 6. 槲皮素 7. 芹菜素 8. 山奈酚

圖1 乙醇提取食用花卉樣品高效液相色譜圖

Figure 1 HPLC
Figure of edible flowers samples extract with ethonal

結合相關研究，苗苗等[20]測的梔子花總黃酮含量為13.3 mg/g ·DW，萬壽菊黃酮含量為121.4 mg/g· DW，本試驗測得的總黃酮含量均高于已有研究。熊麗娜[9]18測得桂花黃酮總量為179.03 mg/g· DW，與本試驗測得結果相近。黃帥等[21]研究表明萬壽菊中存在類胡蘿卜素、沒食子酸、槲皮素等成分；宋家玲等[22]利用各種波普技術鑒定出梔子花中存在山奈酚、槲皮素、β-胡蘿卜苷等15種化合物；李軍茂等[23]利用超高效液相色譜與飛行時間質譜聯用(UHPLC-Q-TOF-MS/MS) 技術鑒定木芙蓉中包含蘆丁、山奈酚、槲皮素等化合物；蔣益花等[24]利用微波技術進行正交試驗，測得木芙蓉中黃酮含量為31.78 mg/g ·DW；尹偉等[25]發現桂花中含有綠原酸、咖啡酸、山奈酚、槲皮素等化合物；衛強等[26]在木槿的乙醇提取物中鑒定出β-胡蘿卜苷、山奈酚、芹菜素等化合物，張文彥等[27]測得木槿花中總黃酮含量為6.01 mg/g· DW，低于本試驗的12.52 mg/g ·DW。在鑒定這6種常見花卉中所含多酚、黃酮的具體成分方面，本試驗結果與已有研究存在一定差異，可能與花卉活性成分的提取方法、試驗條件及花卉的地區不同有一定關系。

2.3 6種食用花卉的抗氧化能力比較

由圖2可知，不同品種花卉中的抗氧化活性具有顯著性差異(P<0.05)。ABTS自由基的清除能力介于100.12～1 708.03 μmol TE/g· DW，其抗氧化活性排序為：黃色萬壽菊>橙色萬壽菊>桂花>芙蓉花>木槿花>梔子花，黃色萬壽菊ABTS活性值的含量約是梔子花的18倍。FRAP抗氧化活性值介于100.20～2 621.25 μmol TE/g· DW，花卉的含量排名與ABTS基本一致，略有不同之處在于梔子花的FRAP抗氧化值略高于木槿花，但二者含量也基本相當，黃色萬壽菊的FRAP抗氧化值也遠高于排名第二的橙色萬壽菊。DPPH自由基清除能力介于45.13～1 092.49 μmol TE/g·DW，其抗氧化活性按照高低次序排列為：橙色萬壽菊>黃色萬壽菊>桂花>芙蓉花>梔子花>木槿花，本試驗測定橙色萬壽菊的DPPH自由基清除能力約是木槿的22倍，金月亭等[28]測得木槿花DPPH自由基清除能力為51.8 μmol TE/g· DW，與本試驗結果比較接近。

同一圖例上不同小寫字母代表抗氧化活性差異顯著(P<0.05) 圖2 6種食用花卉抗氧化活性Figure 2 Antioxidant activity of 6 kinds of edible flowers

熊麗娜[9]30測得桂花ABTS抗氧化活性值為426.6 μmol TE/g· DW，DPPH抗氧化活性值為546.1 μmol TE/g ·DW，FRAP抗氧化活性值為1 556.1 μmol TE/g· DW，其中ABTS 與DPPH的抗氧化活性值與本試驗所得結果相近，而FRAP抗氧化活性值與本試驗結果有較大差距。綜合3種抗氧化測定方法結果，抗氧化活性最強的是黃色萬壽菊，其次是橙色萬壽菊、桂花、芙蓉花、木槿花和梔子花。這一結論與各花卉抗氧化活性成分含量，尤其是多酚含量排名基本一致，證實了唐津忠[29]的觀點，即抗氧化能力與抗氧化成分含量呈正比。食用花卉中各活性成分差異較大，因此，有必要對食用花卉的具體成分進一步分離純化，并比較主要單體活性成分的抗氧化活性及其對抗氧化作用的貢獻、協同抗氧化機理，以推動了食用花卉的開發與綜合利用。

2.4 抗氧化活性成分與抗氧化活性相關性分析

對食用花卉的抗氧化活性成分含量與抗氧化能力進行相關性分析，由于所有變量在5%的顯著水平上均不符合正態分布，故采用Spearman相關性分析，分析結果見表3。DPPH的清除活力與TPC(r=0.943)含量之間有較強的相關性、與TFC(r=0.829)含量之間有較弱的相關性。FRAP與TPC(r=1)、TFC(r=0.943)含量間有顯著的相關性。ABTS與TPC(r=0.943)含量之間有強相關性、與TFC(r=0.886)含量間有較弱的相關性，證實了太志剛[30]的觀點，即通過ABTS法發現白刺花提取物清除ABTS+自由基的能力隨含量的增加而增強。同時3種抗氧化活性(DPPH、ABTS、FRAP)之間的相關性表現出顯著性水平，相關系數在P<0.01水平上至少達到0.886，表明抗氧化活性測定都是可靠和可互換的。李華等[31]測得DPPH與ABTS、DPPH與FRAP、ABTS與FRAP的相關性均達0.999 8。本試驗測得DPPH與FRAP相關性r=0.943(P<0.01)、FRAP與ABTS相關性r=0.943(P<0.01)，DPPH與ABTS相關性r=0.886(P<0.01)，都有較顯著的相關性。

表3食用花卉的抗氧化活性成分與抗氧化活性斯皮爾曼相關系數?

Table 3 Spearman correlation coefficients between the antioxidant activity and the antioxidant contents of edible flowers

相關系數DPPHFRAPABTSTPCTFCDPPH1.0000.943**0.886*0.943**0.829*FRAP1.0000.943**1.000**0.943**ABTS1.0000.943**0.886*TPC1.0000.943**TFC1.000

? **代表在置信度(雙側)為0.01時，相關性是顯著的。

3 結論

本研究測定了木槿花、梔子花、芙蓉花、桂花、黃色萬壽菊和橙色萬壽菊的主要抗氧化活性成分及其抗氧化的能力。通過高效液相色譜分離技術，得出6種食用花卉共有的活性成分含量的總體趨勢是：黃酮>多酚>山奈酚>槲皮素>類胡蘿卜素。通過對6種食用花卉的11種活性成分的總量比較，抗氧化活性成分含量最高的為黃色萬壽菊，其余的高低排列順序為橙色萬壽菊、桂花、梔子花、芙蓉花和木槿花。通過Spearman相關性分析表明，食用花卉的抗氧化活性成分含量與抗氧化能力有顯著相關性。多酚和黃酮的含量與DPPH、FRAP和ABTS間存在顯著的相關性，但黃酮的含量與DPPH的抗氧化能力間的相關性未達到極顯著水平，這對抗氧化活性物質的針對性利用提供了理論依據。綜合3種抗氧化活性測定方法(DPPH、FRAP和ABTS)，得出每種抗氧化活性測定方法中抗氧化活性最強的花卉品種不同。抗氧化活性最強的是黃色萬壽菊，其次是橙色萬壽菊、桂花、芙蓉花、木槿花和梔子花。本研究對于食用花卉的綜合利用具有一定的指導意義，但對花卉抗氧化各組分抗氧化及協同作用和抗氧化機理仍有待進一步研究。