昆侖雪菊茶總黃酮提取及抗氧化活性研究

王家妮 明 建,2 田 勇 王榮杰 李福香

(1. 西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715； 2. 西南大學(xué)國(guó)家食品科學(xué)與工程實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，重慶 400715)

昆侖雪菊學(xué)名兩色金雞菊(CoreopsistinctoriaNutt.)[1]，系菊科(Compositae)金雞菊屬(Coreopsis)一年生草本植物，因其生長(zhǎng)在新疆昆侖山脈海拔3 000 m以上的高寒積雪地區(qū)而得名“雪菊”[2]。研究表明，昆侖雪菊含有黃酮、有機(jī)酸、皂苷、鞣質(zhì)、不飽和脂肪酸、三萜類(lèi)、多肽類(lèi)等多種活性成分[3-4]，其中黃酮類(lèi)化合物含量最為豐富[5]。昆侖雪菊黃酮具有抗氧化[6-7]、降血脂[8]、降血糖[9]、抗炎[10]、降血壓[11]和抗衰老[12]等多種生物活性。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)昆侖雪菊黃酮類(lèi)化合物的提取主要采用有機(jī)溶劑法[13-14]，鮮有用水直接浸提的研究報(bào)道。但在日常生活中，雪菊的主要攝入方式為傳統(tǒng)茶飲，因此更應(yīng)當(dāng)關(guān)注其親水活性成分。李寶文等[15]研究了昆侖雪菊中水溶性黃酮的提取工藝，其提取方法不同于傳統(tǒng)茶飲沖泡，而模擬傳統(tǒng)茶飲沖泡方式，更具有實(shí)際價(jià)值。因此，本研究模擬傳統(tǒng)茶飲沖泡方法，對(duì)昆侖雪菊茶總黃酮進(jìn)行水浸提，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化浸提工藝，并對(duì)昆侖雪菊茶總黃酮的體外抗氧化活性進(jìn)行研究，以期為昆侖雪菊茶飲的開(kāi)發(fā)及研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

昆侖雪菊：采自新疆昆侖山海拔3 000 m以上的高寒地區(qū)，購(gòu)于新疆和田地區(qū)；

蘆丁、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、熒光素鈉鹽(FL)、6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(Trolox)：分析純，美國(guó)Sigma公司；

2,2′-偶氮二異丁基脒鹽酸鹽(ABAP)：分析純，日本W(wǎng)ako Chemicals公司；

亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵等：分析純，成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

分光光度計(jì)：JH722型，上海精科科學(xué)儀器廠；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-2型，常州澳華儀器有限公司；

分析天平：FA1004A型，上海精天電子儀器有限公司；

pH計(jì)：PB-10型，德國(guó)賽多利斯公司；

微型臺(tái)式離心機(jī)：1-15PK型，德國(guó)賽多利斯公司；

多功能酶標(biāo)儀：Syhergy H1型，美國(guó)基因公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 單因素試驗(yàn)

(1) 浸提時(shí)間：精確稱取3.0 g昆侖雪菊樣品放入三角瓶中，按料液比1∶80 (g/mL)與水混合，在90 ℃下分別浸提2，5，8，11，14，17 min，測(cè)定浸提時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響。

(2) 浸提溫度：精確稱取3.0 g昆侖雪菊樣品放入三角瓶中，按料液比1∶80 (g/mL)與水混合，分別在75，80，85，90，95，100 ℃下浸提14 min，測(cè)定浸提溫度對(duì)總黃酮得率的影響。

(3) 料液比：精確稱取3.0 g昆侖雪菊樣品放入三角瓶中，分別按料液比1∶50，1∶60，1∶70，1∶80，1∶90，1∶100 (g/mL)，在90 ℃條件下浸提14 min，測(cè)定料液比對(duì)總黃酮得率的影響。

1.3.2 雪菊茶總黃酮含量測(cè)定

(1) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：參照文獻(xiàn)[16]。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程：Y= 0.012 7x-0.011 4(R2=0.999 7)。

(2) 樣品黃酮含量的測(cè)定：取1 mL茶湯樣品(可作適當(dāng)稀釋)，置于25 mL容量瓶中，后續(xù)操作與標(biāo)準(zhǔn)曲線制備相同。

1.3.3 雪菊茶總黃酮得率計(jì)算

(1)

式中：

c——提取率，%；

m1——提取的總黃酮質(zhì)量，g；

m2——干燥原料的質(zhì)量，g。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化浸提工藝 結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)雪菊茶總黃酮浸提工藝進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及回歸方程方差分析。以總黃酮得率為響應(yīng)值，浸提時(shí)間、浸提溫度、料液比作為考察因素，選取5個(gè)中心點(diǎn)進(jìn)行17個(gè)試驗(yàn)，并對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析。

1.3.5 昆侖雪菊茶抗氧化活性測(cè)定

(1) 清除DPPH·能力：根據(jù)Cheung等[17]的方法。按式(2)計(jì)算DPPH·清除能力。

(2)

式中：

K——DPPH·清除率，%；

Ai——樣品液吸光度；

Aj——純水吸光度。

(2) 鐵還原能力測(cè)定(FRAP)：根據(jù)Luanda等[18]的方法。

(3) 氧自由基吸收能力測(cè)定(ORAC)：根據(jù)Wolfe等[19]的方法。按式(3)、(4)分別計(jì)算AUC值和ORAC值。

AUC=(0.5×f1/f1+f2/f1+f3/f1+……+fn/f1+……+f30/f1+0.5×f30/f1)×CT，

(3)

(4)

式中：

f1——第1次熒光讀數(shù)；

fn——第n次熒光讀數(shù)；

CT——間隔測(cè)定時(shí)間4.5 min；

AUC樣品——樣品熒光衰減下的面積；

AUC空白——空白液熒光衰減下的面積。

用Trolox當(dāng)量(μmol TE/g)來(lái)表示ORAC值。

1.4 試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，Origin 8.0軟件進(jìn)行單因素試驗(yàn)分析，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方差分析使用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行。所有試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 浸提時(shí)間對(duì)昆侖雪菊茶總黃酮得率的影響 由圖1可知，在2～11 min時(shí)雪菊茶總黃酮得率隨浸提時(shí)間的增加而增加，超過(guò)11 min以后基本保持不變。分析其原因可能是昆侖雪菊中黃酮隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)不斷溶出，當(dāng)時(shí)間達(dá)到11 min時(shí)，雪菊中黃酮基本溶出，此后隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮得率不再變化。因此選擇最佳浸提時(shí)間為11 min。

圖1 浸提時(shí)間對(duì)昆侖雪菊茶總黃酮提取的影響

Figure 1 Effect of extraction time on the yield of flavonoids ofCoreopsistinctoriatea

2.1.2 浸提溫度對(duì)昆侖雪菊茶總黃酮得率的影響 由圖2可知，在一定溫度范圍內(nèi)，昆侖雪菊茶總黃酮得率與浸提溫度呈正相關(guān)，當(dāng)浸提溫度達(dá)到95 ℃時(shí)，總黃酮得率達(dá)到最大值18.22%，當(dāng)溫度高于95 ℃雪菊茶總黃酮得率有所下降。因此選擇最佳浸提溫度為95 ℃。

2.1.3 料液比對(duì)昆侖雪菊茶總黃酮得率的影響 由圖3可知，隨著加水量的增加，昆侖雪菊茶總黃酮得率呈先增加后減少的趨勢(shì)，在料液比為1∶80 (g/mL)時(shí)總黃酮得率達(dá)到最大值，與宋佳敏等[20-21]研究結(jié)果一致。這可能是當(dāng)加水量較少時(shí)，在稀釋作用下黃酮隨著提取液的增加溶出更加充分，但加水量太大會(huì)導(dǎo)致體系的比熱容增大，可能會(huì)加劇對(duì)黃酮結(jié)構(gòu)的破壞[21]。因此選擇最佳料液比為1∶80 (g/mL)。

圖2 浸提溫度對(duì)昆侖雪菊茶總黃酮提取的影響

Figure 2 Effect of extraction temperature on the yield of flavonoids ofCoreopsistinctoriatea

圖3 料液比對(duì)昆侖雪菊茶總黃酮提取的影響

Figure 3 Effect of material-to-liquid ratio on the flavonoids ofCoreopsistinctoriatea

2.2 提取工藝的優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)昆侖雪菊茶總黃酮得率有影響的浸提時(shí)間、浸提溫度、料液比因素，設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)。表1為因素水平編碼表，表2為試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及結(jié)果。

表1 設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 Factor level and coding of Box-Behnken design

使用Design Expert 8.0.6軟件，對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到如表3所示的該模型回歸方程方差分析表，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性回歸的二項(xiàng)式擬合，得到以下預(yù)測(cè)模型：

R=19.86+0.76A+0.71B+0.21C+0.12AB-0.21AC-0.14BC-0.61A2-0.79B2-0.17C2。

(5)

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Design-expert design scheme and experimental results

從表3可以看出，3個(gè)因素的一次項(xiàng)及二次項(xiàng)對(duì)總黃酮得率的影響極顯著(P<0.01)，3個(gè)因素之間交互作用均顯著(P<0.05)。由F值可知，各因素對(duì)昆侖雪菊茶總黃酮得率影響的大小次序依次為：浸提時(shí)間>浸提溫度>料液比。

表3 優(yōu)化后模型方差分析表?Table 3 Significance test for coefficient of the regression model developed

? **表示極顯著(P<0.01)，*表示顯著(0.01

2.2.2 響應(yīng)面分析 圖4可以直觀地反映出浸提時(shí)間、浸提溫度和料液比三因素之間的交互作用對(duì)總黃酮得率的影響。各因素對(duì)總黃酮得率的影響程度可以通過(guò)響應(yīng)曲面陡峭程度反映，響應(yīng)曲面陡峭表明對(duì)總黃酮得率影響顯著，響應(yīng)曲面平緩，表明該因素對(duì)總黃酮得率影響不顯著[22]。比較模型的響應(yīng)曲面陡峭程度：浸提時(shí)間>浸提溫度>料液比，表明各因素對(duì)總黃酮提取率的影響大小順序?yàn)椋航釙r(shí)間>浸提溫度>料液比，其結(jié)論同表3方差分析結(jié)論一致。等高線的形狀可反映出各因素間交互作用的強(qiáng)弱，趨于橢圓形表明兩因素的交互作用顯著，而圓形表明不顯著[23]，圖4(a)～(c)中各因素相互作用得到的等高線均為橢圓形，表明浸提時(shí)間與浸提溫度、浸提時(shí)間與料液比、浸提溫度與料液比交互作用顯著，與模型的方差分析結(jié)果一致。

2.2.3 最優(yōu)浸提工藝條件的驗(yàn)證 根據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件，結(jié)合實(shí)際操作條件，響應(yīng)面優(yōu)化的模型得出最優(yōu)條件為：浸提時(shí)間13 min、浸提溫度98 ℃、料液比1∶78 (g/mL)，提取率為20.30%。根據(jù)優(yōu)化后的最佳工藝參數(shù)提取，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，黃酮得率為(20.39±0.07)%，與預(yù)測(cè)模型得出的理論值相比較，偏差<0.33%，說(shuō)明該模型具有可靠性，可以用于預(yù)測(cè)昆侖雪菊茶浸提總黃酮得率。

2.3 雪菊茶的體外抗氧化活性評(píng)價(jià)

如圖5所示，昆侖雪菊茶DPPH·清除能力的半數(shù)有效濃度值(IC50)為(82.40±1.98) μg/mL，弱于抗壞血酸的[(18.70±0.89) μg/mL]；鐵還原力IC50值為(137.98±1.56) μg/mL，弱于抗壞血酸的[(60.41±0.62) μg/mL]，表明昆侖雪菊茶具有一定的鐵還原能力及抗氧化活性。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)昆侖雪菊茶的ORAC值為1 427.89 μmol TE/g·DW，顯著高于徐維盛等[24]測(cè)定的閔紅茶(1 379.10 μmol TE/g·DW)、烏龍茶(1 270.70 μmol TE/g·DW)以及古丈毛尖茶(1 247.10 μmol TE/g·DW)，表明昆侖雪菊茶具有良好的氧自由基清除能力。

圖4 等高線及響應(yīng)曲面圖Figure 4 Contour plots and response surface

圖5 昆侖雪菊茶抗氧化能力Figure 5 Antioxidant Capacity of Coreopsis tinctoria tea

3 結(jié)論

本研究通過(guò)模擬日常沖泡花茶的方法，以昆侖雪菊茶總黃酮浸出得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)和Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化昆侖雪菊茶浸提總黃酮的最佳工藝條件，并評(píng)價(jià)其體外抗氧化活力。工藝優(yōu)化結(jié)果表明，最佳浸提條件為：浸提時(shí)間13 min、浸提溫度98 ℃、料液比1∶78 (g/mL)，該條件下昆侖雪菊茶中總黃酮得率高達(dá)20.30%，以數(shù)學(xué)模型得到的浸提條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，相對(duì)誤差較小(RSD<0.33%)，表明回歸模型優(yōu)化得到的浸提工藝條件是有效的，具有實(shí)用價(jià)值。

另外，昆侖雪菊茶黃酮的抗氧化活性研究表明，在一定濃度范圍內(nèi)，昆侖雪菊茶抗氧化能力隨總黃酮濃度的增加而增加，且線性關(guān)系良好。昆侖雪菊茶的清除DPPH·IC50值為(82.40±1.98) μg/mL，還原鐵離子的IC50值為(137.98±1.56) μg/mL，ORAC值為1 427.89 μmol TE/g·DW，表明昆侖雪菊茶表現(xiàn)出較好的抗氧化活性，可作為一種天然抗氧化劑來(lái)源，具有良好的發(fā)展前景。

本研究以水為溶劑，采用傳統(tǒng)茶飲沖泡方式，更具有實(shí)際意義。本文僅研究了昆侖雪菊茶中總黃酮的浸提工藝條件及體外抗氧化活性，而昆侖雪菊茶飲中總黃酮的開(kāi)發(fā)利用及抗氧化有效單體成分有待進(jìn)一步研究。