壇紫菜多酚提取工藝及體外抗氧化與抑菌活性研究

陳洪彬 宋露露 金瑾萱 程永強

(1. 泉州師范學院海洋與食品學院，福建 泉州 362002；2. 福建省海洋藻類活性物質與功能開發重點實驗室， 福建 泉州 362002；3. 中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083)

壇紫菜(Porphyrahaitanensis)又名紫菜、烏菜，是中國浙江、福建和廣東沿海主要養殖的大型藻類[1]。根據2016年中國漁業統計分析，2015年中國養殖紫菜約1.16×105t，其中福建養殖約5.3×104t，占中國總產量近50%[2]，但每年用于鮮食或加工的均為前2～3次收割的紫菜，末水殘次壇紫菜基本被廢棄，占總量10%以上。壇紫菜富含膳食纖維和蛋白質，營養和藥用價值極高，提取低值壇紫菜中的有效活性成分可以提高其附加值，減少資源浪費和環境污染，為紫菜深加工拓寬新渠道。

海藻多酚主要是海藻植物中的間苯三酚衍生物或其聚合物，具有抗氧化、抑菌、增強機體免疫等多種生理活性[3-4]。福建的紫菜資源豐富，有關紫菜有效活性成分的研究主要集中在多糖[5-7]、多肽[8-9]方面，有關多酚類的研究還處在起步階段。Kazowska等[10]研究表明，紫菜多酚通過提高巨噬細胞中一氧化氮的含量來抵抗體外炎癥的發生。李鋒等[11]對壇紫菜多酚進行分離純化，發現壇紫菜多酚除了具有較強的體外抗氧化能力，還可以抑制皮膚表皮的紫外線傷害。也有研究[12]發現，紫菜多酚提取物能顯著抑制中國對蝦冷藏過程中微生物的增殖作用，保持較好的冷藏對蝦品質。李穎暢等[13]和鐘明杰等[14]分別采用超聲波和微波輔助提取紫菜多酚，可以較好地提高紫菜多酚的提取率。超聲波輔助提取法因其機械效應和熱效應，具有高提取率、低能量和可有效保護活性成分的生理作用等優勢，在活性物質提取方面被廣泛應用[13,15]。目前，有關超聲波輔助提取壇紫菜多酚研究較少，對壇紫菜多酚的體外抗氧化活性評價以清除DPPH自由基和羥基自由基能力為主[11,14,16]，方式較為單一，而有關壇紫菜多酚的抑菌活性評價鮮見報道。本試驗以福建養殖的壇紫菜為原料，利用超聲波輔助提取壇紫菜多酚，在預試驗的基礎上，考察液料比、超聲時間和乙醇濃度對壇紫菜多酚含量的影響，通過響應面法優化壇紫菜多酚的提取工藝參數；采用DPPH自由基和ABTS自由基清除能力及氧自由基吸收能力(ORAC)來系統評價壇紫菜多酚體外抗氧化活性，采用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌和藤黃八疊球菌來系統評價其體外抑菌活性，為壇紫菜多酚的利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

壇紫菜：石獅古浮四水壇紫菜，烘干粉碎至80目，備用(含水量為4.58%±0.11%)；

多功能酶標儀：Infinite 200 PRO型，瑞士帝肯集團公司；

紫外可見分光光度計：T6型，北京普析通用儀器有限責任公司；

分析天平：CP224C型，奧豪斯儀器上海有限公司;

萬能粉碎機：ZN-02型，北京興時利儀器有限公司；

高速冷凍離心機：GL-20G-II型，上海安亭科學儀器廠；

全自動菌落計數儀：SupcreG6R型，杭州迅數科技有限公司；

隔水式恒溫培養箱：GHP-9050型，上海一恒科學儀器有限公司；

雙頻數控超聲波清洗器：KQ-300VDE型，昆山市超聲儀器有限公司；

1，1-二苯基苦基苯肼(DPPH)：分析純，美國西格瑪奧德里奇公司；

FL熒光素鈉、AAPH、Trolox、2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、過硫酸鉀等：分析純，德國克雷貝爾公司；

沒食子酸、福林酚、無水碳酸鈉、無水乙醇、牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂粉等：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 壇紫菜多酚提取工藝

壇紫菜→粉碎→過篩(80目)→超聲輔助提取→離心(8 000 r/min，30 min)→壇紫菜多酚提取液

1.2.2 多酚含量的測定 參考陳洪彬等[15]的方法，以沒食子酸計，用mg GAE/g表示(烘干后粉末重量)。

1.2.3 壇紫菜多酚體外抗氧化活性和抑菌活性的測定

(1) DPPH自由基清除率：參照文獻[15]。

(2) ABTS自由基清除率：參照文獻[17]。

(3) 氧自由基吸收能力：參照文獻[18]。

(4)IC50值：參照文獻[15]。

(5) 抑菌效果：采用打孔法評價，用自動菌落計數聯用儀記錄抑菌圈的直徑。

1.2.4 單因素和響應面試驗設計

(1) 液料比：在超聲時間40 min、乙醇濃度60%的條件下，分別考察不同液料比[20∶1，30∶1，40∶1，50∶1，60∶1(mL/g)] 對壇紫菜多酚含量的影響，重復3次，取平均值。

(2) 超聲時間：在液料比30∶1 (mL/g)、乙醇濃度60%的條件下，分別考察不同超聲時間(10，20，30，40，50 min)對壇紫菜多酚含量的影響，重復3次，取平均值。

(3) 乙醇濃度：在液料比30∶1 (mL/g)、超聲時間40 min 的條件下，分別考察不同乙醇濃度(20%，40%，60%，80%，100%)對壇紫菜多酚含量的影響，重復3次，取平均值。

(4) 響應面試驗：在單因素試驗的基礎上，以液料比、超聲時間、乙醇濃度為試驗因素，以壇紫菜多酚含量為評價指標，設計三因素三水平響應面試驗優化壇紫菜多酚超聲波輔助法提取工藝條件。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 液料比 由圖1可知，隨著液料比的增加，壇紫菜多酚含量呈先升高后降低的趨勢。在液料比為30∶1 (mL/g)時，壇紫菜多酚含量最高，為(6.80±0.04) mg GAE/g，之后壇紫菜多酚含量有所下降。這是因為液料比過低不利于壇紫菜多酚的溶出，而較高的液料比將溶出更多雜質，影響多酚的溶出，同時也增加后續濃縮成本。本研究多酚含量的變化趨勢與李穎暢等[13]的研究結果類似。因此，選擇液料比為30∶1 (mL/g)。

2.1.2 超聲時間 由圖2可知，隨著超聲時間的延長，壇紫

圖1 液料比對壇紫菜多酚含量的影響

Figure 1 Effects of liquid-material ratio on the contents of polyphenols fromPorphyrahaitanensis

菜多酚含量升高。在超聲10～30 min時，壇紫菜多酚含量增加快速，之后緩慢升高，到超聲40 min時，壇紫菜多酚含量達到最大值，之后趨于穩定。這是因為超聲達到一定時間后，壇紫菜多酚已基本溶出，再延長超聲時間，已經無法再有多酚溶出。該多酚含量的變化趨勢與陳洪彬等[15]的類似。因此，選擇超聲時間為40 min。

圖2 超聲時間對壇紫菜多酚含量的影響

Figure 2 Effects of ultrasonic times on the contents of polyphenols fromPorphyrahaitanensis

2.1.3 乙醇濃度 由圖3可知，乙醇濃度對壇紫菜多酚含量的影響較大。隨著乙醇濃度增加，壇紫菜多酚含量整體呈先升高后下降的趨勢。乙醇濃度在20%～60%時，超聲輔助提取的壇紫菜多酚含量快速升高，乙醇濃度在60%時，壇紫菜多酚含量達到最大值，為(6.81±0.06) mg GAE/g，之后壇紫菜多酚含量快速下降，當乙醇濃度達到100%時，壇紫菜僅有少量多酚被超聲浸出。這可能是海藻中的多酚類物質以間苯三酚及其衍生物為主[3]，水溶性較高，過高的乙醇濃度不利于多酚物質的溶出。因此，選擇乙醇濃度為60%。

2.2 響應面法優化設計

2.2.1 試驗設計與結果分析 根據單因素試驗結果，以壇紫菜多酚含量作為響應值。根據Box-Benhnken 中心組合原理進行響應面設計，試驗因素水平表見表1，試驗設計與結果見表2。

圖3 乙醇濃度對壇紫菜多酚含量的影響

Figure 3 Effects of ethanol concentration on the contents of polyphenols fromPorphyrahaitanensis

表1 因素和水平表Table 1 Factors and levels in response surface design

表2 壇紫菜多酚提取響應面試驗設計及結果Table 2 Response surface design arrangement and experimental results

利用Design-Expert 8.05軟件對響應面試驗結果進行分析，得到以壇紫菜多酚含量(Y)為響應值的回歸方程：

Y=6.71+0.26A+0.39B+0.51C+0.04AB-0.29AC-0.30BC-0.18A2-0.52B2-0.47C2。

(1)

對各項方差的進一步分析可知，3個因素對壇紫菜多酚含量的影響順序為：乙醇濃度>超聲時間>料液比。其中，B、C、B2和C2項對壇紫菜多酚含量的影響達到極顯著水平，A、AC和BC項達到顯著水平。在α=0.05顯著水平下將不顯著項進行剔除，得到優化后的回歸方程：

Y=6.63+0.26A+0.39B+0.51C-0.29AC-0.30BC-0.53B2-0.48C2。

(2)表3 方差分析?Table 3 ANOVA of the constructed regression model

2.2.2 試驗因素間的交互作用 對表3進一步分析，發現乙醇濃度與液料比、超聲時間的交互項對壇紫菜多酚含量的影響達到顯著水平(P<0.05)，其中乙醇濃度與超聲時間之間對壇紫菜多酚含量的交互影響最大。為更直觀說明交互影響作用，對交互項作響應曲面圖和等高線圖。由圖4可以看出，乙醇濃度和超聲時間之間的響應面曲面坡度陡峭，等高線圖呈扁平橢圓狀，說明乙醇濃度和超聲時間之間具有較強的交互作用，對壇紫菜多酚含量的影響大。

2.2.3 最佳工藝參數 進一步分析響應面分析回歸方程，得到壇紫菜多酚提取最優工藝參數為：液料比35.06∶1 (mL/g)、超聲時間43.08 min、乙醇濃度65.86%，此時超聲輔助提取壇紫菜多酚的理論含量為6.91 mg GAE/g。為檢驗響應面結果的可靠性，對最優工藝參數進行驗證實驗(n=3)，根據實際操作情況，將驗證條件修正為液料比35∶1(mL/g)、超聲時間43 min、乙醇濃度66%，此時提取的壇紫菜多酚含量為(6.85±0.13) mg GAE/g。

2.2.4 體外抗氧化和抑菌活性評價 根據響應面優化工藝結果，制備壇紫菜多酚，采用DPPH自由基和ABTS自由基清除能力及氧自由基吸收能力(ORAC)評價該壇紫菜多酚的體外抗氧化活性，以抗壞血酸為陽性對照，結果見表4和圖5。由表4可知，壇紫菜多酚具有一定的抗氧化活性，其多酚含量與DPPH自由基、ABTS自由基清除率呈線性正相關性。壇紫菜多酚的DPPH自由基清除率IC50值為(36.54±0.75) μg/mL，是陽性對照抗壞血酸的2.33倍，說明它的體外抗氧化效果低于同濃度下的抗壞血酸；壇紫菜多酚的ABTS自由基清除率IC50值為(16.07±0.32) μg/mL，略弱于同濃度下抗壞血酸的[抗壞血酸ABTS自由基IC50值為(11.96±0.26) μg/mL]。根據圖5，按文獻[17]的計算方法，得到壇紫菜多酚的氧自由基吸收能力值為(1 005.1±11.8) μmol TE/g，說明壇紫菜多酚具有較高的抗氧化能力。

圖4 乙醇濃度和超聲時間對壇紫菜多酚含量的交互影響Figure 4 Interaction effects of ethanol concentration and ultrasonic times on the contents of polyphenols from Porphyra haitanensis表4 壇紫菜多酚和抗壞血酸的DPPH自由基、ABTS自由基清除率IC50值Table 4 IC50 values for DPPH free radical, ABTS free radical of polyphenols from Porphyra haitanensis and ascorbic acid

評價指標評價對象回歸方程R2IC50/(μg·mL-1)DPPH自由基壇紫菜多酚y=0.898 6 x+17.1090.990 636.54±0.75抗壞血酸 y=2.157 7 x+16.0730.995 215.71±0.18ABTS自由基壇紫菜多酚y=2.783 5 x+5.322 80.991 616.07±0.32抗壞血酸 y=3.604 6 x+6.933 40.996 311.96±0.26

圖5 紫菜粗多酚和水溶性VE溶液熒光衰減曲線

Figure 5 The attenuation curve of fluorescence intensity ofPorphyrahaitanensispolyphenol and trolox

由表5可知，不同濃度的壇紫菜多酚對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌和藤黃八疊球菌的抑菌效果不同，隨著壇紫菜多酚濃度的增加，其抑菌圈直徑逐漸增大，對不同微生物的抑制效果也隨之提高。進一步分析可知，壇紫菜多酚對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌和藤黃八疊球菌的最小抑菌濃度分別為1，1，1，2 mg/mL。因此認為，壇紫菜多酚具有一定抑菌活性。

3 結論

本研究利用超聲波輔助提取四水壇紫菜中的多酚，以多酚含量為評價指標，通過單因素和響應面試驗確定壇紫菜多酚最佳提取工藝條件為液料比35∶1 (mL/g)、超聲時間43 min、乙醇濃度66%，在此條件下，壇紫菜多酚含量為(6.85±0.13) mg GAE/g，與鐘明杰等[14]采用微波輔助提取的紫菜多酚相比含量要高，可能是微波輻射破壞多酚的結構。同時，本研究結果與李穎暢等[13]采用超聲波輔助提取的紫菜多酚含量基本一致，說明利用超聲波輔助提取紫菜多酚的方法可靠，為低值壇紫菜制備多酚的工業化生產提供技術參數。通過體外抗氧化和抑菌試驗，發現壇紫菜多酚具有較強的抗氧化活性和抑菌活性，是一種潛在的天然抗氧化和抑菌物質，但有關它的抗氧化、抑菌活性及其他生物活性和構效關系有待進一步深入研究。

表5 不同濃度壇紫菜多酚的體外抑菌效果?Table 5 Bacteriostasis effects of different concentrations of polyphenols from Porphyra haitanensis in vitro

? 牛津杯內徑6 mm，外徑8 mm。