復合酶水解卵白蛋白及其特性與結構分析

劉麗莉 陳 珂 李 玉 代曉凝 孟圓圓

(河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471003)

中國是世界上第一雞蛋生產大國，蛋品深加工比例卻不到1%[1]，這種現狀嚴重限制了中國蛋品行業的發展。雞蛋清粉是蛋品深加工中產量最大的制品之一，但它的功能特性及局限性影響了其在食品加工中的應用。卵白蛋白又稱卵清蛋白(Ovalbumin, OVA)，是雞蛋清中的主要成分，其分子量為44.5 kDa[2]。等電點為4.5，由4個自由巰基和1個包埋在OVA中心的二硫鍵組成[3]。OVA中疏水氨基酸含量為50%[4]。OVA作為模式蛋白能較好地體現雞蛋清的功能特性。

目前，提高蛋白質的功能特性主要是通過對蛋白質改性實現的[5]。國內外關于雞蛋清蛋白改性的報道有很多，如許美玉等[6]通過堿性蛋白酶酶解改善OVA的乳化性，并優化了酶解工藝條件，使其酶解OVA的乳化活性較未改性OVA提高了89.61%。Lechevalier等[7]研究了干熱處理對蛋清粉功能、營養和過敏性的影響。Xiong等[8]研究了高強度超聲波(HIUS)對OVA結構和性質的影響。本課題組[9]前期利用堿性蛋白酶對OVA進行酶解處理，發現酶解后OVA溶解度和乳化性明顯提高。酶法改性可以將大分子的蛋白質降解成小分子肽甚至更小的氨基酸，同時產生具有生物活性的物質，從而提高了人體對其的消化吸收[10]。

市場上的雞蛋清粉由于溶解度差、腥味重等缺點限制了其在食品加工中的應用，所以需要應用適當的方法對蛋清粉進行改性以開發出功能特性較好的蛋清粉。而針對OVA改性的探討對提高整體蛋清粉的功能特性起到關鍵作用。生物酶解改性方法是當前蛋白質較為理想的改性方法，它具有安全、高效、作用條件溫和的優點。但目前針對酶解OVA改性的相關文獻研究[6, 9]多集中在單一酶源的篩選和應用，OVA的水解度偏低，而且缺乏針對酶解改性后OVA特性與結構的深入分析。本試驗擬在前期單一酶酶解OVA試驗[9]基礎上，采用復合酶對OVA進行酶解改性，以提高OVA的功能特性從而開發出高附加值的功能性蛋清粉，為雞蛋深加工制品提供一種新途徑。

1 材料與設備

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

木瓜蛋白酶(1.0×104U/g)、中性蛋白酶(5.0×104U/g)和風味蛋白酶(1.6×104U/g)：上海藍季生物有限公司；

酒石酸鉀鈉：分析純，濟南金日和化學試劑有限公司；

溴酚藍、溴化鉀：分析純，上海一研生物有限公司；

尿素、三羥甲基氨基甲烷：分析純，上海山浦化工有限公司。

1.1.2 儀器與設備

高速分散均質機：HD-1604型，北京杰瑞恒達科技有限公司；

磁力加熱攪拌器：78-1型，深圳美達儀器有限公司；

高速分散均質機：HD-1604型，北京杰瑞恒達科技有限公司；

超速冷凍離心機：H1650型，北京興達恒信科技有限公司；

全自動凱氏定氮儀：K9860型，濟南海能儀器股份有限公司；

磁力加熱攪拌器：78-1型，深圳美達儀器有限公司；

熒光分光光度計：Cary eclipse型，美國Aglient公司；

掃描電鏡：EM-30Plus型，韓國COXEM公司。

1.2 方法

1.2.1 OVA的酶解工藝 稱取一定質量的OVA粉溶解于蒸餾水中，配制成OVA溶液，調節溫度和pH，加入一定量的復合酶，再滴加NaOH來維持pH值恒定，反應一段時間后，置于90 ℃水浴中滅酶10 min，冷卻后于10 000 r/min離心10 min，取上清液測水解度，將上清液冷凍干燥，即得OVA肽。

1.2.2 復合酶配比選擇 配制3%蛋白濃度的OVA溶液，pH為8，總酶量5 000 U/g(木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和風味蛋白酶的質量比分別為2∶1∶1，1∶1∶2，1∶2∶1)，在50 ℃ 的水浴鍋中加熱4 h，測定其水解度。并以3種單一酶作為對照。

1.2.3 OVA酶解工藝優化

(1) pH的選擇：固定酶解時間6 h，底物OVA濃度5%，加酶量8 000 U/g，溫度60 ℃，分別考察不同pH(5，6，7，8，9)對酶解反應水解度的影響。

(2) 酶解時間的選擇：固定pH 7，底物OVA濃度5%，加酶量8 000 U/g，溫度60 ℃，分別考察不同酶解時間(2，4，6，8，10 h)對酶解反應水解度的影響。

(3) 底物OVA濃度的選擇：固定pH 7，酶解時間6 h，加酶量8 000 U/g，溫度60 ℃，分別考察不同底物OVA濃度(2%，3%，4%，5%，6%，7%)對酶解反應水解度的影響。

(4) 加酶量的選擇：固定pH 7，酶解時間6 h，底物OVA濃度5%，溫度60 ℃，分別考察不同加酶量(4 000，5 000，6 000，7 000，8 000，9 000 U/g)對酶解反應水解度的影響。

(5) 溫度的選擇：固定pH 7，酶解時間6 h，底物OVA濃度5%，加酶量8 000 U/g，分別考察不同溫度(40，45，50，55，60，65 ℃)對酶解反應水解度的影響。

1.2.4 OVA酶解的響應面優化試驗 在單因素試驗基礎上，利用Design-Expert 8.0.5軟件，以水解度為響應值，設計五元二次通用旋轉組合試驗。

1.2.5 水解度測定 采用甲醛滴定法測定氨基態氮含量，凱氏定氮法測定總氮含量[11]。水解度(DH)按式(1)計算：

(1)

式中：

DH——水解度，%；

N1——上清液中氨基態氮含量，mol/L；

N0——樣品中總氮含量，mol/L。

1.2.6 OVA功能特性的測定

(1) 持水性和持油性的測定：稱取0.1 g待測樣品于離心管中稱量總重，加入3 mL水(或大豆油)，靜置30 min后，于10 000 r/min離心10 min，稱量沉淀與離心管總重[12]。按式(2)計算蛋白質持水性和持油性。

(2)

式中：

WAC——蛋白質持水性，g/g；

OAC——蛋白質持油性，g/g；

W0——待測樣品的重量，g；

W1——待測樣品和離心管的總重量，g；

W2——沉淀與離心管總重量，g。

(2) 表面疏水性的測定：參照Chelh等[13]的方法，將OVA、OVA肽分別溶于pH 7.4 Tris-HCl緩沖液中，加入1 mg/mL 溴酚藍溶液200 μL，于10 000 r/min離心10 min，取上清液稀釋10倍后在595 nm處測定吸光值，以Tris-HCl緩沖液為空白，以1 mL pH 7.4的Tris-HCl緩沖液加1 mg/mL 溴酚藍為對照。蛋白質表面疏水性按式(3)計算：

(3)

式中：

SH——蛋白質表面疏水性，%；

A0——1 mL pH 7.4的Tris-HCl緩沖液加1 mg/mL溴酚藍為對照的吸光值；

A1——上清液稀釋10倍后在595 nm處測定吸光值。

(3) 濁度的測定：取一定量的OVA、OVA肽分別加入pH 7.4的Tris-HCl緩沖液，配制成2.5 mg/mL溶液，于6 000 r/min 均質1 min，使其充分溶解，以不加樣品的Tris-HCl緩沖液作為空白組，在340 nm處測定樣品吸光度值(A340 nm)，吸光值表示其濁度[14]。

1.2.7 OVA結構表征

(1) 化學作用力的測定：根據文獻[15]的方法，修改如下，準確稱取1 g OVA和OVA肽，分別加入10 mL的0.05 mol/L NaCl(SA)、0.6 mol/L NaCl(SB)、0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L尿素(SC)、0.6 mol/L NaCl+8.0 mol/L尿素(SD)、0.6 mol/L NaCl+8.0 mol/L尿素+1.5 mol/Lβ-巰基乙醇(SE)，于10 000 r/min均質1 min后，4 ℃靜置2 h，然后于10 000 r/min冷凍離心10 min，取上清液。采用標準曲線法計算上清液中不同蛋白質含量。分別按式(4)～(7)計算離子量含量、氫鍵含量、疏水相互作用含量和二硫鍵含量。

IC=C2-C1，

(4)

HB=C3-C2，

(5)

HI=C4-C3，

(6)

DB=C5-C4，

(7)

式中：

IC——離子量含量，%；

HB——氫鍵含量，%；

HI——疏水相互作用含量，%；

DB——二硫鍵含量，%；

C1——溶解于SA的蛋白質含量，%；

C2——溶解于SB的蛋白質含量，%；

C3——溶解于SC的蛋白質含量，%；

C4——溶解于SD的蛋白質含量，%；

C5——溶解于SE的蛋白質含量，%。

(2) 熒光光譜分析：將待測樣品溶于pH 7.4的Tris-HCl緩沖液中，配制成濃度為1 mg/mL的蛋白溶液，激發和發射單色器的帶寬均為5 nm，在激發波長為295 nm，掃描范圍300～450 nm的條件下，測定待測樣品的熒光發射光譜。

(3) 掃描電鏡(SEM)分析：分別將OVA、OVA肽進行噴金處理，再將樣品置于掃描電子顯微鏡下觀察樣品的微觀結構。

1.2.8 數據分析 每個樣品重復3次試驗，采用Design-Expert 8.0.5軟件進行響應面試驗設計及方差分析，Origin 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 復合酶配比的篩選

復合酶配比對OVA水解度的影響見圖1。

由圖1可知，采用復合酶酶解OVA的水解度顯著優于單一酶(P<0.05)；而且不同配比的復合酶酶解OVA水解度的順序為1∶1∶2>1∶2∶1>2∶1∶1，當3種酶的質量比為1∶1∶2時，水解度達到最大值，為26.54%，故3種酶復合的比例選用1∶1∶2。

圖1 復合酶配比對OVA水解度的影響Figure 1 Effect of enzyme ratio on degree of hydrolysis and of OVA

2.2 單因素試驗

不同酶解條件對水解度的影響見圖2。

由圖2(a)可知，當pH<7時，水解度隨著pH升高而升高；當pH>7時，水解度隨著pH的升高而下降；當pH為7時，水解度達到最大值。可能是3種酶的最適pH均在7左右[16]，當pH>7時，酶的活性受到影響，水解度降低，因此OVA的酶解pH為7時較為適宜。

由圖2(b)可知，水解度隨著OVA酶解時間的延長，呈先升高后下降的趨勢；當酶解時間為6 h時，水解度出現最大值。可能是在一定酶解時間內，隨著酶解時間的延長，酶作用在OVA上，使其斷裂成大小不一的多肽分子，OVA中可被酶解的肽鍵逐漸增多，水解度變大；而后隨著酶解時間的延長，酶的活性下降，進而造成水解度逐步下降[17]。因此酶解時間選擇6 h。

由圖2(c)可知，當OVA濃度<5%時，水解度逐漸增加；當OVA濃度>5%時，水解度呈逐漸下降趨勢。這可能是當OVA濃度逐漸增大時，復合酶和OVA結合的幾率增大，OVA酶解較徹底，水解度逐漸增大；而當OVA濃度繼續增大時，導致酶與蛋白之間接觸減小，酶解液黏度變大，溶解性降低，OVA酶解進行較慢，從而導致水解度降低[18]。因此，OVA濃度選定為5%。

由圖2(d)可知，水解度隨著加酶量的增加，呈先增加后減少的趨勢。原因是隨著加酶量的增加，酶與OVA結合的幾率增大，反應速率升高，水解度相應增大；但隨著加酶量的增多，底物OVA相對不足，導致反應進程減弱，水解度逐漸減小。因此，加酶量選定為8 000 U/g。

由圖2(e)可知，隨著溫度的升高，水解度先上升后下降；在60 ℃時，水解度達到最大值。可能是溫度過高導致蛋白酶變性，從而使酶解反應速率降低[19]。所以，溫度選定為60 ℃。

2.3 二次回歸正交旋轉試驗

通過五因素三水平通用旋轉試驗對復合酶酶解制備OVA肽的工藝進行響應面優化，其試驗設計方案及結果見表1、2。

圖2 酶解條件對水解度的影響Figure 2 Influence of different enzymatic conditions on degree of hydrolysis表1 五元二次通用旋轉組合設計試驗因素與水平Table 1 Factors and levels used in second-ordel rotation combination experimental design

水平X1 pHX2 酶解時間/hX3 底物OVA濃度/%X4 加酶量/(U·g-1)X5 溫度/℃-26.06.03.07 00050.0-16.56.54.07 50052.507.07.05.08 00055.017.57.56.08 50057.528.08.07.09 00060.0

表2五元二次通用旋轉組合試驗設計方案及結果

Table 2 Quadratic orthogonal rotary composite experimental design in terms of coded values of five variables and corresponding experimental results

試驗號X1X2X3X4X5水解度/%11111127.132111-1-129.68311-11-127.68411-1-1129.4951-111-126.6261-11-1130.9971-1-11130.4681-1-1-1-126.069-1111-127.4110-111-1130.9611-11-11127.5812-11-1-1-126.4513-1-111127.6314-1-11-1-126.6415-1-1-11-125.8116-1-1-1-1125.0917-2000026.55182000028.37190-200027.82200200028.792100-20025.59220020027.1223000-2029.23240002026.79250000-228.12260000230.59270000030.28280000030.59290000030.29300000031.08310000030.12320000031.14

對表2中水解度的試驗數據進行多元回歸擬合，得到水解度的回歸方程為：

(8)

該水解度模型在α=0.05水平下剔除不顯著項后的回歸方程為：

(9)

2.3.1 方差分析和顯著性檢驗 由表3可知，Y1回歸模型的R2=96.43，P<0.000 1，差異極顯著，失擬項P=0.158 6>0.05，差異不顯著，說明Y1模型的擬合度較高。因此該回歸模型可以較好地反映自變量與響應值之間的變化關系。

2.3.2 雙因素交互效應分析 由圖3可知，響應面呈拋物線形，等高線呈橢圓形，說明底物OVA濃度與加酶量的交互作用對水解度影響極顯著，這與表3中顯著性分析結果一致。由等高線的變化趨勢可看出，當底物OVA濃度低于5.0%～5.5%中某固定值、加酶量低于7 750～8 000 U/g中某固定值時，隨著底物OVA濃度與加酶量增加，水解度增加；當底物OVA濃度高于5.0%～5.5%中某固定值、加酶量高于7 750～8 000 U/g中某固定值時，隨著底物OVA濃度與加酶量的增加，水解度減小；當底物OVA濃度為5%、加酶量為8 000 U/g時，水解度為30.28%。

由圖4可知，酶解時間與加酶量的響應面呈拋物線形且

表3 水解度的方差分析表Table 3 Analysis of variance for the hydrolysis degree

圖4 酶解時間與加酶量交互作用對水解度的影響Figure 4 Response surface and corresponding contour plots showing the effect of interaction of hydrolysis time and enzyme dosage on degree of hydrolysis

比較陡峭，等高線呈明顯的橢圓形，說明酶解時間與加酶量對水解度影響有極顯著的交互作用。由等高線的變化趨勢可看出，當酶解時間低于7.0～7.3 h中某固定值、加酶量低于7 750～8 000 U/g中某固定值時，隨著底物OVA濃度與加酶量增加，水解度增加；當底物OVA濃度高于7.0～7.3 h中某固定值、加酶量高于7 750～7 938 U/g中某固定值時，隨著底物OVA濃度與加酶量的增加，水解度減小。

2.4 利用回歸方程確定最佳作用參數和模型驗證

經五元二次正交旋轉試驗及響應面優化法，采用Design Expert 8.0軟件和回歸方程分析得到復合酶酶解OVA的最佳工藝為：pH 7.5、酶解時間7.29 h、底物OVA濃度5.28%、加酶量7 529.72 U/g、溫度56.42 ℃，此時水解度為31.22%。為了提高復合酶酶解制備OVA肽試驗的操作性和驗證模型的準確性，將預測的最優工藝條件修改為：pH 7.5、酶解時間7 h、底物OVA濃度5%、加酶量7 500 U/g、溫度56 ℃。在此條件下做3次重復驗證實驗，實際測得水解度為(31.03±0.14)%。水解度的實際值與預測值相差0.61%，說明水解度的模型方程與實際結果擬合度良好，證明響應面優化復合酶酶解OVA的工藝條件是可行的。

2.5 復合酶酶解對OVA功能特性的影響

由表4可知，OVA肽的持水性較OVA提高了1.65 g/g。可能是酶解使蛋白分子斷裂，形成小分子肽鏈，從而使其結合水的能力增強，持水性增強[20]。與持水性相反，OVA肽的持油性較OVA降低了1.05 g/g，主要是蛋白的持油性與表面疏水性有關，表面疏水基團減少，與油結合機會減少造成的。OVA肽較OVA的表面疏水性大小明顯減小了4.05%(P<0.05)，造成的主要原因是復合酶酶解得到的OVA肽的溶解度升高，表面疏水性相應降低[21]。OVA肽的濁度大小呈下降趨勢且差異顯著[22](P<0.05)，這是因為OVA肽是由OVA經酶解得到了分子量較小的多肽或者氨基酸，OVA肽能與水形成氫鍵，使其溶解度較OVA升高濁度下降[23]。

2.6 復合酶水解OVA結構表征

2.6.1 化學作用力分析 酶解改性對OVA化學作用力即離子鍵、氫鍵、疏水相互作用、二硫鍵的影響見表5。相對于OVA，OVA肽的離子鍵含量明顯減少(P<0.05)，這是因為酶解改性使得離子鍵發生了斷裂，導致OVA肽的離子鍵含量較OVA分別下降6.63%。氫鍵的穩定性弱于離子鍵，經酶解處理后的OVA即OVA肽的氫鍵發生斷裂使其含量較OVA明顯減少17.29%(P<0.05)。OVA肽的疏水相互作用含量較OVA分別減少4.35%，可能是酶解使蛋白質分子量變小，親水基團增多，溶解性升高，疏水相互作用減弱；另外，OVA肽的羰氨縮合破壞了蛋白質分子的疏水性相互作用，最終導致OVA肽的疏水相互作用含量較OVA明顯減少(P<0.05)。相對于OVA，酶解制備的OVA肽的二硫鍵含量均明顯減少(P<0.05)，可能是酶解改性破壞了半胱氨酸殘基，使二硫鍵的形成受阻[24]。

表4 酶解改性對OVA功能性質的影響?Table 4 Effect of the enzymatic modification on functional properties of OVA

? 不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

表5 酶解改性對OVA化學作用力的影響?Table 5 Effect of the enzymatic modification on chemical reaction of OVA %

? 不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.6.2 熒光光譜分析 對OVA和復合酶酶解制備的OVA肽進行熒光光譜分析，結果見圖5。

從圖5可以看出，相對于OVA，OVA肽的熒光強度均有所降低；最大吸收峰位置也發生了改變，OVA的最大吸收峰在340 nm處，OVA肽的最大吸收峰紅移至345 nm處。可能是熒光強度與表面疏水性呈正相關，酶解改變了OVA的空間構象，使其氫鍵更加穩定，表面疏水性降低，OVA肽熒光強度減弱。

2.6.3 掃描電鏡(SEM)分析 對OVA和復合酶酶解制備的OVA肽進行SEM測定分析，結果見圖6。

由圖6中可知，OVA為典型的球蛋白，表面光滑，成顆粒狀。酶解之后，表面不規則的凹陷消失，顆粒變小。說明酶解改性使其微觀結構發生明顯變化。

圖5 熒光光譜分析Figure 5 Analysis of fluorescence spectroscopy

圖6 改性前后OVA的SEM圖Figure 6 Scanning electron micrographs of OVA before and after modification

3 結論

本試驗研究了木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和風味蛋白酶復合酶水解OVA及其特性與結構，確定了3種酶的最佳質量比和最適酶解工藝條件。結果表明，與單一酶相比，復合酶顯著性提高了OVA的水解度。通過對改性后的OVA特性分析表明，酶解作用顯著提高了OVA的功能特性，如持水性提高、表面疏水性和濁度降低等。為了更加深入地了解OVA相關功能性質變化的機理，通過測定化學作用力分析經酶解改性后OVA的離子鍵、氫鍵、疏水相互作用、二硫鍵的變化；采用熒光光譜和掃描電鏡觀察改性后OVA結構的變化。結果表明蛋白質的三股螺旋結構發生了明顯的變化，同時，OVA的微觀結構由球狀完全變成片狀，表明酶解改性對OVA結構產生顯著性的影響。但針對改性后的OVA結構與功能特性之間的構效機制還有待進一步的深入探討。