牡丹提取物及乳酸菌替代低溫火腿腸中亞硝酸鹽的研究

袁 玲 諸葛斌 于司達(dá) 宗 紅 陸信曜

(1. 江南大學(xué)糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部 重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；3. 江南大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)微生物研究中心，江蘇 無錫 214122)

低溫肉制品因其最大限度地保留了原料肉的風(fēng)味物質(zhì)、營養(yǎng)成分及其良好的口感而受到青睞，是未來熟食肉制品發(fā)展的方向。亞硝酸鹽長期以來作為發(fā)色劑應(yīng)用于肉制品，其優(yōu)點(diǎn)是可使肉制品呈現(xiàn)鮮艷的亮紅色，抑制脂質(zhì)氧化，還具有抑制肉毒桿菌及增強(qiáng)風(fēng)味的作用，但亞硝酸鹽可以和仲胺類物質(zhì)反應(yīng)生成強(qiáng)致癌物亞硝胺[1-2]，對人體健康產(chǎn)生威脅，因此替代肉制品中亞硝酸鹽一直是人們研究的熱點(diǎn)。

天然提取物來源安全，且大部分具有重要的生理功能[3]，已被用于食品、化妝品以及藥品等領(lǐng)域，近年來利用天然提取物替代亞硝酸鹽在肉制品中的發(fā)色和抗氧化作用的研究亦有進(jìn)展。Riazi等[4]研究發(fā)現(xiàn)在牛肉火腿腸中添加1%的紅葡萄果渣可以替代牛肉腸中60%的亞硝酸鈉使用量，黃度值(b*)和亮度值(L*)降低，而抗氧化作用不受影響；Sabrine等[5]使用墨角藻黃素將香腸中亞硝酸鈉使用量由150 mg/kg降至80 mg/kg，且抗氧化效果、火腿腸紅度值與使用150 mg/kg亞硝酸鈉的效果相近。

牡丹提取物是由干燥的牡丹花苞采用乙醇提取法制備而成，含有芍藥素-3,5-O-二葡萄糖苷、天竺葵色素-3,5-O-二葡萄糖苷等多種花色苷類天然色素，具有很強(qiáng)的抗氧化性[6]，但其在肉制品中的應(yīng)用研究尚未有報(bào)道，另外，乳酸菌是當(dāng)今國際公認(rèn)的食品安全級微生物，在發(fā)酵過程中能大量產(chǎn)生乳酸、酒石酸和檸檬酸等有機(jī)酸，這些有機(jī)酸除具有天然防腐抑菌作用外，還能賦予食品柔和的酸味和香氣，具有改善食品風(fēng)味、增強(qiáng)營養(yǎng)等功能[7-8]。因此，本研究擬利用牡丹提取物及乳酸菌發(fā)酵液代替低溫肉制品中的部分亞硝酸鹽，考察其對火腿腸顏色、質(zhì)構(gòu)、脂質(zhì)氧化程度、微生物菌落總數(shù)和風(fēng)味的影響，為實(shí)現(xiàn)低硝低溫肉制品的生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

豬瘦肉、肥肉、鹽、蔗糖、復(fù)合磷酸鹽、味精、五香粉、料酒：購自無錫市歐尚超市；

小麥淀粉、大豆分離蛋白：江蘇全盈生物科技公司；

Nisin：效價(jià)2×106IU/mg，蘭州偉日生物工程有限公司；

牡丹花苞：洛陽紅，河南洛陽；

葡萄糖、乙酸鈉、檸檬酸氫二銨、乙醇、2-硫代巴比妥酸、K2HPO4·H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、EDTA、三氯乙酸等試劑：國產(chǎn)分析純；

牡丹提取物：采用乙醇提取法[乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%、溫度為70～80 ℃、料液比1∶10(g/mL)的條件下回流提取2 h]從干燥的洛陽紅牡丹花苞中提取并冷凍干燥成凍干粉。

1.1.2 菌株及培養(yǎng)基

短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)：由本研究室分離獲得并保存；

MRS培養(yǎng)基：葡萄糖20.0 g、牛肉膏10.0 g、蛋白胨10.0 g、乙酸鈉5.0 g、酵母膏5.0 g、檸檬酸氫二銨1.45 g、吐溫80 1.0 g、K2HPO4·H2O 2.6 g、MgSO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·4H2O 0.25 g、去離子水1 000 mL，pH 6.2～6.4。

1.1.3 儀器

蒸汽滅菌鍋：YXQ-LS-50S11型，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；

電熱恒溫培養(yǎng)箱：GNP-9080型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

高速冷凍離心機(jī)：Thermos-21R型，上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司；

ISQ單四級桿氣質(zhì)聯(lián)用儀：Trace1310-ISQ LT型，美國賽默飛世爾科技公司；

物性分析儀：TA.XT Plus型，英國SMS公司；

高精度分光測色儀：UltraScan Pro1166型，美國Hunterlab公司。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌發(fā)酵液制備 將Lactobacillusbrevis活化后以2%的接種量接種于100 mL的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h后將發(fā)酵液(pH為4.3±0.1)于4 ℃、8 000 r/min離心3 min，收集上清后4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 低溫火腿腸配方及制作流程

(1) 配方：豬瘦肉38%、肥肉17%、淀粉10%、大豆分離蛋白4%、鹽1.8%、冰水25%、蔗糖0.7%、復(fù)合磷酸鹽0.04%、味精0.6%、五香粉0.14%、料酒2.5%(按火腿腸總重計(jì))。

(2) 工藝流程：

絞肉→腌制(加入鹽、蔗糖、味精和料酒等調(diào)料，4 ℃腌制2 h)→攪拌(加入淀粉、冰水和大豆分離蛋白)→灌腸→蒸煮(90 ℃，30 min)→冷卻至腸心溫度低于20 ℃

1.2.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 本研究共設(shè)置5個(gè)處理組，包括空白對照(不添加乳酸菌發(fā)酵液、牡丹提取物和亞硝酸鈉)、陽性對照組(添加150 mg/kg亞硝酸鈉)和3個(gè)試驗(yàn)組(以0.3%牡丹提取物和3%乳酸菌發(fā)酵液分別替代陽性對照組1/3、1/2和2/3的亞硝酸鈉用量)；另外在測定火腿腸菌落總數(shù)時(shí)添加500 mg/kg Nisin試驗(yàn)組作為對比。火腿腸制備完成后，置于37 ℃條件下儲藏21 d(經(jīng)阿倫尼烏斯方程Arrhenius equation換算此儲藏條件相當(dāng)于4 ℃條件下的194 d)備用檢測。

1.2.4 火腿腸顏色的測定 將火腿腸切成約1 cm高的圓柱體，采用高精度分光測色儀測定火腿腸截面紅度值(a*)，每組重復(fù)6次。

1.2.5 火腿腸質(zhì)構(gòu)的測定 參照文獻(xiàn)[9]。

1.2.6 火腿腸中菌落總數(shù)的測定 參照GB 4789.2—2016《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》的方法。

1.2.7 硫代巴比妥酸反應(yīng)物(TBARS)的測定 參照文獻(xiàn)[10]。

1.2.8 固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(SPME-GC-MS)測定火腿腸揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

(1) 頂空固相萃取條件：在15 mL的頂空瓶中裝入3 g切碎的樣品，在60 ℃下頂空吸收40 min，250 ℃下解吸2 min。

(2) 色譜條件：色譜柱為TG-5石英毛細(xì)柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；載氣(He)流速3.5 mL/min；進(jìn)樣品和接口溫度250 ℃；升溫程序：60 ℃保持2 min，以5 ℃/min升至100 ℃，保持5 min，再以10 ℃/min升至200 ℃，保持7 min；不分流進(jìn)樣。

(3) 質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源(EI)；電子能量70 eV；發(fā)射電流200 μA；離子源溫度230 ℃；四級桿溫度150 ℃；激活電壓350 V；質(zhì)量掃描范圍m/z33～450[11]。

1.2.9 感官評定 由具有感官評定經(jīng)驗(yàn)的10位人員組成評定小組，其中5位女性、5位男性。采用盲評計(jì)分方式及排序法對火腿腸的感官指標(biāo)進(jìn)行評價(jià)。每個(gè)評定成員單獨(dú)進(jìn)行，相互不接觸交流，樣品評定之前用清水漱口。感官評價(jià)內(nèi)容見表1，計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)為10分制，并使用Excel軟件將評分制成雷達(dá)圖。

表1 感官評定內(nèi)容Table 1 Contents of sensory evaluation of sausages

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)氣相質(zhì)譜所得的譜圖，結(jié)合保留指數(shù)和數(shù)據(jù)庫檢索對樣品中揮發(fā)性成分進(jìn)行定性分析，通過面積歸一化法求得各化學(xué)成分在該樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中的相對含量；試驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用Excel、SPSS 22統(tǒng)計(jì)軟件，通過單因素方差(one-way ANOVA)、Fisher LSD分析均值間差異，以P<0.05判斷差異顯著性。

2 結(jié)果與討論

2.1 牡丹提取物及乳酸菌發(fā)酵液對低溫火腿腸紅度值(a*)及質(zhì)構(gòu)的影響

紅度值(a*)是描述肉制品顏色特征的重要參數(shù)[12]，為研究牡丹提取物和乳酸菌發(fā)酵液替代部分亞硝酸鈉對火腿腸顏色的影響，利用測色儀對火腿腸a*值進(jìn)行測定，結(jié)果如圖1所示。牡丹提取物和乳酸菌發(fā)酵液替代亞硝酸鈉火腿腸的a*值均顯著高于空白對照(P<0.05)，替代1/3、1/2亞硝酸鈉火腿腸的a*值顯著高于陽性對照，替代2/3亞硝酸鈉火腿腸的a*值與陽性對照相近，這是由于有色物質(zhì)的添加，會改變火腿腸的顏色狀態(tài)[13]，牡丹提取物中富含多種花色苷類天然色素[14]，對火腿腸紅度有一定促進(jìn)作用。在儲藏過程中，由于火腿腸中脂肪及肌紅蛋白等物質(zhì)的氧化，除了空白對照，其它處理組的a*值均有所降低(差值<2)，與Riazi等[15]使用紅葡萄果渣替代亞硝酸鈉的研究結(jié)果相似。但Savadkoohi等[16]發(fā)現(xiàn)當(dāng)顏色測定參數(shù)差值>2時(shí)才會引起視覺上的顯著差異，因此，牡丹提取物和乳酸菌發(fā)酵液替代亞硝酸鈉火腿腸和陽性對照的a*值降低并不會引起感官評定上顏色的顯著差異。儲藏后期，各處理組火腿腸a*值趨于穩(wěn)定，牡丹提取物和乳酸菌發(fā)酵液替代2/3亞硝酸鈉火腿腸a*值與陽性對照相近。

質(zhì)構(gòu)是評價(jià)火腿腸品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)，由表2可知，以牡丹提取物及乳酸菌發(fā)酵液替代不同量的亞硝酸鈉，火腿腸的硬度、彈性、膠黏性、咀嚼度和恢復(fù)性均無顯著變化(P<0.05)。因此，以牡丹提取物和乳酸菌發(fā)酵液替代2/3用量的亞硝酸鈉，可使火腿腸顏色達(dá)到150 mg/kg亞硝酸鈉的發(fā)色效果且不改變火腿腸良好的質(zhì)構(gòu)特性。

不同小寫字母表示同一貯藏時(shí)間不同樣品之間差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示同一樣品不同貯藏時(shí)間之間差異顯著(P<0.05)

圖1 不同火腿腸顏色的變化

Figure 1 Colorparameters of different emulsion sausages

2.2 牡丹提取物及乳酸菌發(fā)酵液對低溫火腿腸脂質(zhì)氧化的影響

為考察火腿腸脂質(zhì)氧化情況，在儲藏期間對硫代巴比妥酸反應(yīng)物(TBARS)含量進(jìn)行測定，TBARS值越小，脂質(zhì)氧化形成的丙二醛量越少，說明樣品的脂質(zhì)氧化程度越低。如圖2所示，隨著儲藏時(shí)間的延長，各組火腿腸TBARS值不斷升高，空白對照組上升最快，替代1/3、1/2和2/3亞硝酸鈉火腿腸增長速度相對緩慢。與空白對照相比，添加了牡丹提取物及乳酸菌發(fā)酵液的火腿腸TBARS值均顯著降低(P<0.05)，其中，替代1/3和1/2亞硝酸鈉火腿腸的TBARS值顯著低于陽性對照，替代2/3亞硝酸鈉火腿腸的TBARS值與陽性對照相近，這是由于牡丹提取物中含有大量的花青素和沒食子酸等多酚物質(zhì)，活性酚羥基能夠釋放氫離子，從而破壞氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，降低脂肪氧化水平[6,17]。李玉邯等[18]在臘肉中添加鼠尾草提取物(富含多酚類物質(zhì))，也可有效降低臘肉的TBARS值，抑制其脂肪氧化。為使亞硝酸鈉添加量降到最低，此處選擇替代低溫火腿腸中2/3亞硝酸鈉用量。

表2 不同火腿腸的質(zhì)構(gòu)特性Table 2 Texture characteristics of different emulsion sausages

圖2 不同火腿腸TBARS值的變化Figure 2 Variation of TBARS values of different emulsion sausages

綜上，牡丹提取物和乳酸菌發(fā)酵液在低溫火腿腸中具有與亞硝酸鹽相當(dāng)?shù)陌l(fā)色和抗氧化作用，可選擇替代2/3亞硝酸鈉使用量，使亞硝酸鈉添加量由150 mg/kg降至50 mg/kg。

2.3 牡丹提取物及乳酸菌發(fā)酵液在火腿腸中的抑菌作用

為研究添加牡丹提取物和乳酸菌發(fā)酵液替代2/3亞硝酸鈉對火腿腸的抑菌效果，以目前火腿腸中普遍使用的生物防腐劑Nisin為對照，添加量選取Nisin國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的最大限量500 mg/kg，對火腿腸中的菌落總數(shù)進(jìn)行測定，結(jié)果如圖3所示。在37 ℃儲藏條件下，復(fù)配火腿腸(替代2/3亞硝酸鈉火腿腸)菌落總數(shù)顯著低于空白對照和陽性對照(P<0.05)；隨著儲存時(shí)間的延長，空白對照和陽性對照菌落總數(shù)上升趨勢比較明顯，復(fù)配火腿腸在前9 d菌落總數(shù)與添加500 mg/kg Nisin火腿腸相同，第9天后細(xì)菌菌落總數(shù)開始逐漸增加，略高于添加500 mg/kg Nisin的火腿腸。據(jù)GB/T 20712—2006規(guī)定，火腿腸內(nèi)菌落總數(shù)超過50 000 CFU/g(lg 50 000=4.70)，即認(rèn)為是已經(jīng)腐敗不能食用。37 ℃條件下復(fù)配火腿腸在第15天(相當(dāng)于4 ℃條件下138 d)時(shí)達(dá)到腐敗水平，這主要是由于乳酸菌發(fā)酵液中的有機(jī)酸和細(xì)菌素等抑菌性物質(zhì)對火腿腸中的腐敗菌產(chǎn)生較強(qiáng)的抑制作用[19-20]。另外，本實(shí)驗(yàn)室前期研究[21]表明牡丹提取物對大腸桿菌、金黃葡萄球菌和假單胞菌等腐敗菌有較強(qiáng)的抑菌作用，且熱穩(wěn)定性較好，即使在90 ℃條件下處理30 min抑菌活性亦不受影響。因此，牡丹提取物的添加也具有一定的抑菌作用。

復(fù)配火腿腸指0.3%牡丹提取物和3%乳酸菌發(fā)酵液替代陽性對照2/3亞硝酸鈉使用量的火腿腸

圖3 不同火腿腸菌落總數(shù)的變化

Figure 3 Variation of total bacterial count of different emulsion sausages

2.4 牡丹提取物及乳酸菌發(fā)酵液對火腿腸風(fēng)味物質(zhì)的影響

采用SPME-GC-MS對火腿腸揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，在3組火腿腸中均檢測出232種揮發(fā)性化合物，其中對火腿腸風(fēng)味貢獻(xiàn)較大的化合物及其相對含量如表3所示。與空白對照相比，添加牡丹提取物及乳酸菌發(fā)酵液替代2/3亞硝酸鈉的復(fù)配火腿腸中醛類和酮類物質(zhì)相對含量降低，酸類和酯類等風(fēng)味物質(zhì)相對含量升高。添加牡丹提取物和乳酸菌發(fā)酵液后，火腿腸中己醛、戊醛和2,5-辛烷二酮的相對含量下降較為明顯，其中己醛相對含量為6.58%，顯著低于陽性對照(9.38%)，大部分醛類和酮類是脂質(zhì)氧化的產(chǎn)物，這與試驗(yàn)組TBARS值較低的結(jié)果一致。復(fù)配火腿腸中酸類物質(zhì)(如乙酸和辛酸等)含量增加，可能是加入乳酸菌發(fā)酵液中含有大量的乳酸和乙酸等有機(jī)酸，這些有機(jī)酸為火腿腸風(fēng)味的改善起到一定的作用[22]。酯類物質(zhì)中，復(fù)配火腿腸的己酸乙酯相對含量為3.05%，高于空白對照和陽性對照組的1.14% 和2.59%，己酸乙酯具有強(qiáng)烈的曲香香氣和令人愉快的蘋果、菠蘿和香蕉樣的果香，是臘腸的主體風(fēng)味物質(zhì)之一[23]。另外，復(fù)配火腿腸中2-戊基呋喃和麥芽酚相對含量分別為1.72%和0.44%，均高于空白對照組，2-戊基呋喃具有豆香、果香及類似蔬菜的香韻，是肉類特征香料；麥芽酚具有焦奶油硬糖的特殊香氣，稀溶液具有草莓樣芳香味道[24]，這些揮發(fā)性香味物質(zhì)促進(jìn)了復(fù)配火腿腸良好風(fēng)味的形成。

表3 火腿腸揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類及相對含量?Table 3 The variety and relative content of volatile flavor in emulsion sausages %

? 復(fù)配火腿腸指0.3%牡丹提取物和3%乳酸菌發(fā)酵液替代陽性對照2/3亞硝酸鈉使用量的火腿腸；“nd”表示未檢測到；同行不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.5 感官評定

如圖4所示，添加牡丹提取物及乳酸菌發(fā)酵液替代2/3亞硝酸鈉的復(fù)配火腿腸色澤評分顯著高于空白對照組(P<0.05)，與陽性對照相近，呈現(xiàn)出與添加150 mg/kg亞硝酸鈉相似的肉紅色且色澤均勻，火腿腸的質(zhì)地、彈性和口感無明顯改變，與質(zhì)構(gòu)測定結(jié)果一致；復(fù)配火腿腸風(fēng)味評分高于空白對照，牡丹提取物和乳酸菌發(fā)酵液的添加使火腿腸具有獨(dú)特的香味，清爽無油膩感，與陽性對照比較接近。因此，利用0.3%牡丹提取物和3%乳酸菌發(fā)酵液替代低溫火腿腸中2/3亞硝酸鈉用量感官評定總體接受性良好。

復(fù)配火腿腸指0.3%牡丹提取物和3%乳酸菌發(fā)酵液替代陽性對照2/3亞硝酸鈉使用量的火腿腸

圖4 不同火腿腸感官評定得分的雷達(dá)圖

Figure 4 Radar chart of sensory evaluation of different emulsion sausages

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了低溫火腿腸中添加牡丹提取物及乳酸菌發(fā)酵液替代部分亞硝酸鹽的效果。研究表明，在火腿腸中添加0.3%牡丹提取物和3%乳酸菌發(fā)酵液，使火腿腸亞硝酸鈉添加量由150 mg/kg降至50 mg/kg，火腿腸顏色與抗氧化效果不受影響。此外，添加牡丹提取物和乳酸菌發(fā)酵液可使火腿腸菌落總數(shù)顯著降低(P<0.05)，具有一定的抑菌防腐作用；揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中醛類和酮類相對含量下降，酸類和酯類等風(fēng)味物質(zhì)相對含量明顯升高，對改善火腿腸風(fēng)味有一定的貢獻(xiàn)。以上研究結(jié)果表明，牡丹提取物和乳酸菌發(fā)酵液可替代亞硝酸鈉在低溫火腿腸中的發(fā)色和抗氧化功能，同時(shí)具有一定的抑菌和增強(qiáng)風(fēng)味作用，為提高火腿腸品質(zhì)和安全性提供一種新方法，但對于牡丹提取物和乳酸菌發(fā)酵液中活性成分的構(gòu)效關(guān)系及其作用機(jī)制需進(jìn)一步深入研究。