酶法糖基化修飾對玉米醇溶蛋白部分結構及流變學性質的影響

曲 悅 王曉杰 劉曉蘭 叢萬鎖

(1. 齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006； 2. 黑龍江省普通高校農產品加工重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

玉米蛋白粉(Corn Gluten Meal, CGM)是濕法玉米淀粉加工中產量最大的副產物。CGM中含有4種溶解性不同的蛋白質，含量約為62%～71%。其中，醇溶性玉米蛋白的含量為65%～68%，堿溶性谷蛋白的含量為22%～33%，是CGM中2種主要蛋白質[1-2]。玉米醇溶蛋白和谷蛋白在水相中溶解性差的特點嚴重限制了玉米蛋白在食品工業中的應用[2]。如果能對玉米蛋白進行改性，使其溶解性等功能性質顯著改善，則玉米蛋白將有機會應用于食品工業中。

在食品工業中，普遍采用非酶褐變的美拉德反應(Maillard reaction)去改善食物中蛋白質的溶解性等加工特性和抗氧化等生理功能特性[3-5]。但是，該反應存在反應時間長、反應溫度高、營養成分可利用率下降、會產生致突變物(如丙烯酰胺、呋喃、羥甲基糠醛)等缺點。

微生物來源的谷氨酰胺轉氨酶(transglutaminase，TGase)是一種不依賴Ca2+、可以催化蛋白質(或多肽)分子之間發生共價交聯的酰基轉移酶，廣泛應用于肉制品等加工業。TGase催化的酰基轉移反應中，谷氨酰胺殘基上的甲酰胺基提供乙酰基供體，賴氨酸殘基上的ε-氨基提供乙酰基受體[6]。當乙酰基受體由氨基葡萄糖、氨基半乳糖和低聚氨基葡萄糖等含有伯胺基團的糖提供時，則發生了蛋白質的酶法糖基化修飾。用TGase催化的大豆分離蛋白/酪蛋白與氨基葡萄糖/低聚氨基葡萄糖發生糖基化反應時，供體蛋白質的部分物化性質被顯著改善，如溶解性、凝膠性和流變學性質等[7-9]。與美拉德反應相比，酶法糖基化的反應溫度更溫和、反應時間更短，且不會產生美拉德反應中所生產的致突變物，顯示出良好的應用優勢與前景。

玉米蛋白的氨基酸組成特點決定其適合作為TGase的催化底物。但迄今為止，未見用TGase和低聚氨基葡萄糖對玉米醇溶蛋白進行改性的相關文獻報道。本課題組已經用反相高效液相色譜法和紅外光譜法證實了在TGase催化下，低聚氨基葡萄糖共價結合到玉米醇溶蛋白分子上[10]，并建立了玉米醇溶蛋白與低聚氨基葡萄糖之間的TGase酶法糖基化反應體系。在前期研究基礎上，本試驗擬以玉米醇溶蛋白為原料，研究低聚氨基葡萄糖的共價結合對玉米醇溶蛋白部分結構性質及流變學性質的影響，為進一步研究糖基化修飾玉米醇溶蛋白的結構與其生理活性之間的關系提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

低聚氨基葡萄糖：相對分子質量1.5 kDa，青島博智匯力生物科技有限公司；

TGase：酶活力1 000 U/g，泰興市一鳴生物制品有限公司；

5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)：色譜級，上海Sangon有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

數顯恒溫水浴振蕩器：SHZ-A型(往復式)，江蘇金壇醫療儀器廠；

低速常溫離心機：CR21GⅢ型，日立集團；

高級旋轉流變儀：Kinexus型，英國馬爾文公司；

差示掃描量熱儀：Q-20型，美國TA儀器有限公司；

真空冷凍儲存箱：LD-53型，美國Millrock公司；

紫外可見分光光度計：DU800型，貝克曼庫爾特商貿(中國)有限公司；

超低溫冷凍冰箱：BM515型，法國 FROILABO集團。

1.2 方法

1.2.1 玉米醇溶蛋白的提取 參照文獻[11]。

1.2.2 糖基化玉米醇溶蛋白和交聯玉米醇溶蛋白的制備

參照文獻[12]，修改如下：按照酰基供體與酰基受體的摩爾比為1∶3，向玉米醇溶蛋白懸浮液(底物濃度3%)中加入低聚氨基葡萄糖，用2 mol/L NaOH 將反應初始pH調整至 7.7，按照60 U/g蛋白的加酶量加入TGase(為了增加酶的分散性，可事先將TGase配制成1 mL的溶液)，在37 ℃下反應8 h。在此期間，每隔1 h檢測1次pH，使反應體系的pH始終維持在7.7。反應液置于85 ℃水浴鍋中處理5 min 鈍化TGase，冷卻至室溫。為了除去反應體系中未參加反應的低聚氨基葡萄糖，用截斷分子質量2 000 Da的透析袋在4 ℃透析48 h。透析后的樣品經冷凍干燥48 h后即為糖基化玉米醇溶蛋白。交聯玉米醇溶蛋白的制備方法同上，區別僅在于反應體系中不加入低聚氨基葡萄糖。

1.2.3 玉米醇溶蛋白及其糖基化修飾產物游離巰基含量的測定 參照文獻[11]。

1.2.4 玉米醇溶蛋白及其糖基化修飾產物熱變性溫度和變性焓的測定 利用差示掃描量熱儀測定。精確稱取2.5 mg樣品放入鋁盒中，壓蓋密封后置于DSC儀器的樣品支持器上，以密封空鋁盒作為對照。測定條件：氮氣壓力0.05 MPa，升溫速率10 ℃/min，溫度范圍20～180 ℃。

1.2.5 玉米醇溶蛋白及其糖基化修飾產物流變學性質的測定

(1) pH對糖基化玉米醇溶蛋白表觀黏度的影響：在底物濃度為10%的條件下，分別將糖基化玉米醇溶蛋白分散液的pH值調整至6.0，7.0，8.0，8.5，9.0，然后進行表觀黏度的測定，比較不同pH值對糖基化玉米醇溶蛋白表觀黏度的影響。

(2) 表觀黏度的測定：配制底物濃度均為10%(蛋白基)的蛋白質分散液，放在4 ℃冰箱中靜置過夜，使樣品充分水合。用高級旋轉流變儀測定，測定條件：夾具PU60型；剪切速率1～100 s-1；溫度25 ℃。

(3) 黏彈特性的測定：按1.2.5(2)方法制備蛋白質分散液，通過低振幅振蕩試驗確定3種樣品在線性黏彈區的應力振幅值；然后在夾具PU60型、剪切頻率0.1～10.0 Hz、應力振幅值0.12%、溫度25 ℃條件下進行頻率掃描，分析3種樣品分散液的彈性模量(G′)和黏性模量(G″)。

1.2.6 數據的統計學分析 應用SPSS 19.0統計軟件中的LSD和Duncan檢驗對數據進行差異顯著性分析。

2 結果與討論

2.1 TGase糖基化修飾對玉米醇溶蛋白部分結構性質的影響

2.1.1 TGase糖基化修飾對玉米醇溶蛋白游離巰基含量的影響 游離疏基是一個影響蛋白質抗氧化活性和乳化行為的重要參數[11]。糖基化修飾過程會引起蛋白質游離巰基和二硫鍵之間的相互轉化，通過測定游離巰基含量的變化情況可以預測蛋白質在結構方面的變化程度。采用Ellman’s分光光度法測定3種樣品的游離巰基含量，試驗結果見圖1。

由圖1可以看出，與原玉米醇溶蛋白相比，交聯玉米醇溶蛋白的游離巰基含量增加，可能是TGase催化的分子內交聯作用使球狀玉米醇溶蛋白的結構伸展[13]，原包埋在分子內部的含硫氨基酸殘基上的巰基暴露到分子表面，導致游離巰基含量增加；TGase催化的糖基化反應使玉米醇溶蛋白的游離巰基含量降低，可能有以下兩方面的原因：① 糖基化過程中與玉米醇溶蛋白共價結合的長鏈低聚氨基葡萄糖分子，產生了空間位阻，屏蔽了部分游離巰基；② 雖然含有巰基的

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05) 圖1 玉米醇溶蛋白及其糖基化修飾產物的游離巰基含量

Figure 1 The free sulfhydryl groups content of zein and cross-linked as well as glycosylated zein

氨基酸暴露在蛋白質表面，但由于形成的糖基化蛋白結構性質不穩定，隨著糖基化反應程度進一步加深，使得暴露的巰基之間形成新的二硫鍵，致使修飾產物巰基含量下降。游離疏基含量的變化說明了TGase催化的糖基化反應使蛋白質的構象發生變化，使得其功能特性也會發生相應的變化。另外，一些研究[14]結果表明，疏基含量與乳化活性具有顯著的相關性，糖基化玉米醇溶蛋白乳化活性的降低可能與其游離巰基含量下降有關。

2.1.2 糖基化修飾對玉米醇溶蛋白熱變性溫度和變性焓的影響 DSC通過測量在以恒定速率加熱時與分子熱變性相關的熱能改變測定穩定性，熱躍遷中點(Tm)越高，分子越穩定。對玉米醇溶蛋白及其2種糖基化修飾產物進行DSC測定，以表征TGase催化的糖基化反應對玉米醇溶蛋白熱穩定性的影響，試驗結果見圖2和表1。

由表1可以看出，TGase催化的糖基化修飾使玉米醇溶蛋白的變性溫度和總變性焓均發生了不同程度的上升，在整體上提高了玉米醇溶蛋白的熱穩定性。與玉米醇溶蛋白相比，分子內交聯反應使玉米醇溶蛋白的變性溫度和總變性焓變化不顯著，可能與玉米醇溶蛋白的氨基酸組成有關。TGase催化的交聯反應以賴氨酸殘基上的ε-氨基為乙酰基受體，而玉米醇溶蛋白中賴氨酸含量低，導致交聯反應發生幾率低，對玉米醇溶蛋白的熱穩定性影響較小。糖基化反應

圖2 玉米醇溶蛋白及其糖基化修飾產物的DSC曲線Figure 2 DSC profile of zein and its glycosylated products表1 玉米醇溶蛋白及其糖基化修飾產物的變性溫度 和熱變性焓?

Table 1 The denaturation peak temperature and thermodenaturation enthalpy of zein and itsglycosylated products

樣品變性溫度/℃總變性焓/(J·g-1)玉米醇溶蛋白 108.52±2.54a162.45±8.98b交聯玉米醇溶蛋白 112.08±0.91a160.60±11.31b糖基化玉米醇溶蛋白119.52±12.60a234.75±23.93a

? 不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

使玉米醇溶蛋白的變性溫度提高了11 ℃，總變性焓提高了72.3 J/g，可能是與玉米醇溶蛋白共價結合的長鏈低聚氨基葡萄糖分子阻止了蛋白分子之間的相互靠近和作用，進而抑制了蛋白質的變性和聚集沉淀，與遲玉杰等[15]的研究結論相一致。

2.2 糖基化修飾對玉米醇溶蛋白流變學性質的影響

2.2.1 pH對糖基化玉米醇溶蛋白表觀黏度的影響 蛋白質只有處于溶解狀態時才能表現出良好的功能特性，因此，糖基化玉米醇溶蛋白只有處于良好的溶解狀態才能表現出良好的表觀黏度。蛋白質的溶解性受pH影響較大，在高于或低于等電點的pH條件下，會對蛋白質的溶解性產生有益的作用。為了防止樣品中不溶性顆粒對蛋白質表觀黏度測定的影響，在剪切速率為1～100 s-1條件下，測定在不同pH條件下的蛋白分散液的表觀黏度，結果見圖3。

圖3 pH對糖基化玉米醇溶蛋白分散液表觀黏度的影響

Figure 3 Effect of pH on the apparent viscosity of the aqueous dispersions of the glycosylated zein

由圖3可以看出，在底物濃度均為10%條件下，在pH值為6.0時，糖基化玉米醇溶蛋白分散液的表觀黏度值最低；在堿性pH 8.0～9.0值條件下，低剪切頻率時，分散液的表觀黏度呈先上升后降低的趨勢，在高剪切頻率時，分散液的表觀黏度有波動，曲線不光滑，可能是分散液中的不溶性顆粒對表觀黏度的測量產生了影響。pH值為7.0時，分散液的表觀黏度最大，曲線光滑下降，沒有波動，說明此條件下樣品的溶解性最高，避免了分散液中不溶性顆粒對玉米醇溶蛋白表觀黏度測量的影響。因此，選擇底物濃度10%、pH 7.0 的條件進行糖基化玉米醇溶蛋白表觀黏度的測定。

2.2.2 糖基化修飾對玉米醇溶蛋白表觀黏度的影響 將3種玉米醇溶蛋白樣品配置成底物濃度為10%(蛋白基)的分散液，并調節pH值為7.0，在此條件下測定3種玉米醇溶蛋白樣品的表觀黏度，試驗結果見圖4。

圖4 玉米醇溶蛋白及其糖基化修飾產物表觀黏度隨剪切頻率的變化曲線

Figure 4 Apparent viscosity of the aqueous dispersions of zein and cross-linked as well as glycosylated zein

由圖4可以看出，在剪切速率1～100 s-1時，糖基化玉米醇溶蛋白的表觀黏度最大，而交聯玉米醇溶蛋白的表觀黏度大于玉米醇溶蛋白，并且3種樣品的表觀黏度均隨著剪切頻率的增加而逐漸下降，為假塑性流體所特有的剪切稀化現象。

在氨基糖不存在的條件下， TGase催化蛋白質分子內的交聯反應(乙酰基受體由賴氨酸殘基上的ε-氨基提供)，形成了分子質量和體積較大的蛋白質聚合物，增加了蛋白質分散液的表觀黏度，與Song等[16-17]的研究結果一致。在氨基糖存在的條件下，TGase催化的糖基化反應使低聚氨基葡萄糖與玉米醇溶蛋白共價結合，糖分子改善了玉米醇溶蛋白的溶解性，增加了反應體系中蛋白質之間的相互作用，進而增加了表觀黏度。另外，與玉米醇溶蛋白共價結合的糖分子使溶液的黏度增加，對糖基化玉米醇溶蛋白表觀黏度的增加具有促進作用。因此，糖基化玉米醇溶蛋白的分散液表現出最高的表觀黏度。

2.2.3 糖基化修飾對玉米醇溶蛋白黏彈特性的影響 食品的結構、品質與黏彈特性密切相關。在確定應力值為0.12%、剪切頻率范圍為0.1～-10.0 Hz的條件下，測定3種玉米醇溶蛋白樣品分散液的G′和G″，試驗結果見圖5。

從圖5可以看出，在測定的剪切頻率范圍內，玉米醇溶蛋白分散液由類液體特征(剪切頻率0.14～0.72 Hz)轉變為類固體特性(剪切頻率1～10 Hz)，表明玉米醇溶蛋白的交聯程度很弱，處于半流體狀態。TGase催化的糖基化修飾在一定程度上改變了玉米醇溶蛋白的黏彈特性。在剪切頻率為0.19 Hz時，交聯玉米醇溶蛋白的G′和G″值相等；在頻率0.19～1.00 Hz時，G′高于G″，且兩者均隨著剪切頻率的增加而逐漸增加；在頻率1～10 Hz時，G′和G″的值變化幅度較小，說明體系形成了凝膠[18]。在剪切頻率0.1～10.0 Hz時，糖基化玉米醇溶蛋白的G′和G″均隨剪切頻率的增加而增加，且G′始終高于G″，表現為類固體特征，說明糖基化反應促使玉米醇溶蛋白具有更好的增稠作用。

圖5 玉米醇溶蛋白及其糖基化修飾產物的黏彈性 模量隨剪切頻率的變化曲線

Figure 5 Elasticity modulus and viscous modulus of the aqueous dispersions of zein and its glycosylated products

3 結論

針對玉米醇溶蛋白水溶性差的特點，本試驗利用具有多羥基結構的低聚氨基葡萄糖分子對玉米醇溶蛋白進行糖基化改性，以期在改善玉米醇溶蛋白的溶解性的同時，改善玉米醇溶蛋白的結構和功能等性質。游離巰基含量和熱學性質的測定結果表明，TGase催化的低聚氨基葡萄糖的共價結合反應使玉米醇溶蛋白的熱穩定性增加。在剪切速率為1～100 s-1條件下，糖基化玉米醇溶蛋白分散液的表觀黏度最高，并表現出剪切稀化的特性。在剪切頻率0.1～10.0 Hz時，糖基化玉米醇溶蛋白分散液的G′均大于G″，表現為類固體特征。說明與玉米醇溶蛋白和交聯玉米醇溶蛋白相比，低聚氨基葡萄糖的共價結合反應可以在一定程度上改善玉米醇溶蛋白的結構性質和流變學性質。