小檗堿體外對三轉基因阿爾茨海默癥小鼠海馬神經元內質網應激及凋亡的影響

龔瓊，歐陽雅帆，黃艷露，黃敏

(中山大學附屬第七醫院，廣東深圳 518107)

阿爾茨海默癥(AD)是一種以認知功能障礙和學習記憶能力減退為臨床癥狀的神經退行性疾病，腦組織淀粉樣蛋白沉積(Aβ)和Tau蛋白纖維纏結是其病理基礎[1]。內質網應激是AD病因學中的一個重要過程，致病性錯誤折疊蛋白質的積累和細胞內鈣信號的破壞是誘發內質網應激的基礎機制，可導致神經元功能障礙和細胞死亡[2,3]。在有害或者應激條件下，細胞通過激活未折疊蛋白質反應(UPR)的適應性反應途徑逃避嚴重損害。葡萄糖相關蛋白78(GRP78)是通過關鍵途徑啟動UPR的主傳感器[4]。在內質網應激時，錯誤折疊蛋白抑制GRP78和傳感蛋白之間的相互作用，從而啟動UPR信號傳導，產生細胞凋亡作用[5]。小檗堿是從黃連素中提取的一種天然異喹啉類生物堿，具有多種藥理作用[5]，如抗炎、調節血糖、抗病毒、調脂等，而且對神經系統中自身免疫性疾病、腦血管疾病、癲癇、焦慮抑郁、AD等疾病亦有一定改善作用[6,7]。最近研究表明，小檗堿能降低AD中Aβ沉積和改善三轉基因AD小鼠的學習記憶能力[8]。2016年7月～2018年3月，本研究觀察了小檗堿對三轉基因AD小鼠海馬神經元內質網應激及凋亡的影響，現分析結果并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 三轉基因AD小鼠購自美國Jax實驗室，能穩定表達人源突變基因APPSwe、tauP301L以及鼠源突變基因PSl[9,10]。小檗堿購自美國Sigma公司，純度約99%。原代細胞培養皿購自美國Invitrogen公司，DMEM/F12(1∶1)細胞培養液購自美國Gibco公司，MTT試劑盒、細胞裂解液、乳酸脫氫酶(LDH)細胞毒性試劑盒、TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒均購自沈陽萬類生物科技有限公司，二甲基亞砜(DMSO)和3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)購自美國Sigma公司，GRP78、Caspase-3和Bcl-2、Bax以及GAPDH抗體、兔鼠通用二抗均購自美國CST公司。

1.2 原代海馬神經元分離和培養 取出生24 h內的三轉基因AD小鼠，75%乙醇全身消毒，在顯微鏡下無菌條件取出海馬組織，剔除血管膜，用眼科剪剪碎，加入0.125%胰蛋白酶，37 ℃消化30 min，用含10%FBS的DMEM/F12完全培養基終止消化。加入含血清的培養基(高糖EMEM+2 mmol/L谷氨酰胺+0．1 U/mL胰島素+10%FBS)，吹打混勻3次，每次吹打后靜置3～5 min。取上清液，200目細胞篩過濾，4 ℃、1 000 r/min離心5 min。棄掉上清，加入神經元培養基，巴氏管吹打混勻細胞，將細胞接種至培養皿、96孔板中、玻片上、6孔板中(已用0.1 mg/mL多聚賴氨酸包被)，分別加入完全培養皿中，置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養。12 h后更換為無血清的培養基，培養48 h加入阿糖胞苷(終濃度為10 μmol/L)，以抑制非神經元細胞的過度生長，每3～4天換液1次，倒置顯微鏡下觀察神經元生長狀況。

1.3 海馬神經元分組及處理 在上述1.2神經元培養第7天時，隨機分為1 μmol/L小檗堿組、10 μmol/L小檗堿組、對照組，調整細胞密度為5×104/孔，每組設6個復孔，前兩組分別加入1、10 μmol/L小檗堿兩種濃度(小檗堿溶于DMSO中)，對照組加入等體積的DMSO，干預24 h，收集細胞進行后續實驗。

1.4 海馬神經元細胞凋亡率檢測 采用TUNEL法。將上述三組神經元培養基棄掉，PBS洗滌10 min×3次，4%多聚甲醛固定樣本爬片1 h；PBS洗滌玻片5 min×3次，室溫下封閉液封閉玻片30 min；PBS洗滌玻片5 min×3次，加入含0.1%～0.2% Triton X-100的PBS，冰浴5 min。將50 μL酶溶液與400 μL的標記液混合配制成500 μL TUNEL反應試劑，充分混勻后在玻片上滴加50 μL TUNEL反應試劑，37 ℃、避光、濕盒中孵育1 h。PBS洗滌玻片5 min×3次，滴加DAPI，5 min后吸出。PBS洗滌玻片5 min×3次，滴加抗淬滅劑50 μL，封片。采用Image J軟件統計凋亡細胞數目。細胞凋亡率=凋亡細胞數/細胞總數×100%。

1.5 海馬神經元細胞存活率檢測 采用MTT法。以5×103/孔的細胞密度接種于96孔細胞培養板中，培養板中事先用多聚賴氨酸處理，培養第7天時加入無血清的培養基洗滌3次，1 μmol/L小檗堿組、10 μmol/L小檗堿組分別加入1、10 μmol/L小檗堿，對照組加入等體積的DMSO，每組設6個復孔，檢測小檗堿作用24 h時，各組細胞相對存活率。采用酶標儀(波長570 nm)檢測各孔吸光度(A)值。對照組細胞存活率標化為100%，計算細胞相對存活率。細胞相對存活率(%)=(實驗孔A570值/對照組A570值)×100%。

1.6 海馬神經元培養上清液LDH釋放率檢測 取上述3組培養基上清液，4 ℃、1 000 r/min離心5 min，收集上清液，其他步驟按照LDH細胞毒性試劑盒說明書操作，酶標儀(波長490 nm)檢測小檗堿干預24 h各孔A490nm值。LDH釋放率(%)=(處理樣品A490值-樣品對照孔A490值)/(細胞最大酶活性A490值-樣品對照孔A490值)×100%。

1.7 海馬神經元細胞GRP78、Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達檢測 采用Western blotting法。將上述1.3中的3組細胞培養基棄掉，用PBS洗滌3次，加入簡易型細胞裂解液(Lysis Buffer+PMSF+蛋白酶抑制劑)200 μL至6孔板，充分吹打，然后超聲破碎、離心，提取上清液，BCA法蛋白定量合格。然后進行SDS凝膠電泳，電泳結束將蛋白電泳產物轉印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST洗滌10 min×3次，分別加入一抗[GRP78(1∶1 000)、Caspase-3(1∶3 000)、Bcl-2(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、GAPDH(1∶3 000)]，4 ℃過夜；次日PBST洗滌10 min×3次，室溫下加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5 000)。TBST洗滌10 min×3次，采用萬類ECL發光液顯影，GraphPad Prism5分析作圖,數據圖片采用Quanlity One軟件掃描。以GAPDH為內參，計算目的蛋白相對表達量。目的蛋白相對表達量=目的蛋白電泳條帶灰度值/GAPDH蛋白電泳條帶灰度值。

2 結果

2.1 各組海馬神經元細胞凋亡率比較 1 μmol/L小檗堿組、10 μmol/L小檗堿組、對照組海馬神經元細胞凋亡率分別為(23.43±3.21)%、(16.72±4.02)%、(43.59±3.68)%，組間兩兩比較P均<0.05。

2.2 各組海馬神經元細胞存活率比較 1 μmol/L小檗堿組、10 μmol/L小檗堿組、對照組海馬神經元細胞存活率分別為(48.25±12.09)%、(67.16±11.41)%、(39.57±13.54)%，組間兩兩比較P均<0.05。

2.3 各組海馬神經元培養上清液LDH釋放率比較 1 μmol/L小檗堿組、10 μmol/L小檗堿組、對照組海馬神經元培養上清液LDH釋放率分別為(12.43±3.41)%、(8.23±2.58)%、(18.79±4.23)%，組間兩兩比較P均<0.05。

2.4 各組海馬神經元細胞GRP78、Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達比較 見表1。

表1 各組海馬神經元細胞GRP78、Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白相對表達量比較

注：與對照組相比，*P<0.01；與1 μmol/L小檗堿組相比，#P<0.05。

3 討論

AD發病的因素包括Aβ沉積、Tau蛋白過度磷酸化、活性氧自由基增多等，這些因素均能導致內質網的錯誤折疊蛋白增加，從而引發內質網應激[3]。早期內質網應激是細胞對傷害的適應性反應，持久或過強的內質網應激則可導致細胞凋亡。有研究表明，抑制過度的內質網應激能明顯減少細胞凋亡。GRP78是誘導內質網應激發生的關鍵分子蛋白，是內質網應激的標志性蛋白，可調節內質網應激的錯誤折疊蛋白功能，從而抑制內質網損傷。有研究表明，在氧化應激失衡、缺血缺氧等狀態下內質網會激活細胞內的UPR，從而激活轉錄因子6和啟動GRP78基因，上調GRP78蛋白表達，進而改善內質網功能[3,4]。

本研究結果發現，與對照組比較，1 μmol/L小檗堿組、10 μmol/L小檗堿組細胞凋亡率、LDH釋放率下降，細胞存活率增加，且10 μmol/L小檗堿組變化更明顯。表明小檗堿能降低神經元細胞凋亡率、抑制LDH釋放水平，對三轉基因AD小鼠海馬神經元具有明確的保護作用，且具有量效關系。

目前小檗堿發揮神經保護作用的具體機制還不清楚。有文獻報道，小檗堿能通過增加自噬水平LC3-Ⅱ、Beclin-1表達，降低Aβ沉積和改善認知功能，同時減少海馬區神經元凋亡[8]。此外，Liang等[11]研究表明，小檗堿能通過降低Aβ25-35誘導體外原代神經元線粒體細胞色素C水平，提高其抗氧化能力，從而降低神經元凋亡。本研究進一步探索小檗堿對AD神經元的保護作用是否與抑制內質網應激有關。

本研究結果發現，1 μmol/L小檗堿組、10 μmol/L小檗堿組GRP78蛋白表達高于對照組，且10 μmol/L小檗堿組GRP78蛋白表達更高，表明小檗堿可呈劑量依賴性上調GRP78蛋白表達，從而改善內質網功能。內質網應激可激活UPR，UPR分別是由GRP78蛋白和RNA激活蛋白樣內質網激、ATF-6等組成，能啟動內質網應激進而介導凋亡信號通路，激活下游信號通路，如Caspase、CHOP、Bcl-2家族等[12]。Caspase-3在執行凋亡過程中發揮重要作用，最終導致細胞凋亡[13,14]。本研究結果發現，1 μmol/L小檗堿組、10 μmol/L小檗堿組較對照組Caspase-3、Bax蛋白表達降低，Bcl-2蛋白表達增加。由此推測，小檗堿可增加GRP78蛋白及抑制Caspase-3蛋白表達，幫助糾正及重組錯誤折疊蛋白、細胞未折疊的正確組裝，抑制內質網應激；同時上調抗凋亡蛋白Bcl-2表達及下調促凋亡蛋白Bax表達，減少神經細胞凋亡，對AD神經元發揮保護作用。但小檗堿何種濃度對AD神經元有最佳保護作用仍需進一步研究。

綜上所述，小檗堿體外可抑制三轉基因AD小鼠海馬神經元內質網應激，減少神經元凋亡，保護三轉基因AD小鼠海馬神經元。其機制可能與上調GRP78蛋白、抗凋亡蛋白Bcl-2表達及抑制Caspase-3蛋白、促凋亡蛋白Bax表達有關。干預內質網應激相關蛋白GRP78表達，可能對AD治療具有潛在意義。