小鼠肌源性干細胞懸浮培養的可行性

于璐，徐筑秋，馮蔚楓，陸海濱，周經，黃慜璐，楊曉楠，祁佐良

(中國醫學科學院整形外科醫院，北京100144)

肌源性干細胞(MDSC)是存在于成體動物肌肉組織中的一種具有自我更新和多向分化潛能的干細胞群。正常條件下MDSC在體內可分化為肌管和肌纖維，從而使注射入骨骼肌或心肌內的移植物保持長期持久性[1，2]。在特定條件下，MDSC能被誘導分化為內皮細胞、骨細胞、脂肪細胞、神經細胞等，可用于治療壓力性尿失禁、杜氏肌營養不良、周圍神經缺損修復和心血管疾病等[3]。目前MDSC的獲取主要通過差速貼壁法培養，但細胞貼壁量小、擴增時間長，使用時需用胰酶消化，可導致細胞損傷。2017年8～12月，我們利用MDSC不易貼壁的特性，采取懸浮培養法在培養皿中對肌源性原代細胞進行純化培養并提取MDSC，旨在探討懸浮培養法獲取MDSC的可行性。現報告如下。

1 材料

2周齡C57BL/6小鼠，由中國醫學科學院整形外科醫院提供，實驗動物使用許可證號：SYXK(京)2015-0009。IMDM培養基、FBS、馬血清、雙抗溶液、Ⅰ型膠原酶、中性蛋白酶Dispase Ⅱ均購自美國Sigma公司，普通中性蛋白酶、佛司可林(Forskolin)購自北京索萊寶科技有限公司，乙二胺四乙酸(EDTA)胰蛋白酶購自美國Sigma公司，表皮細胞生長因子(EGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、Heregulin-β1均購自美國Peprotech公司，甘油磷酸購自北京酷來搏科技有限公司，NB4I酶購自德國Serva公司，雞胚提取物(CEE)購自美國Gemini公司，異硫氰酸熒光素標記大鼠抗小鼠抗干細胞抗原1(Sca-1)購自美國BD公司，eFluor660標記抗小鼠CD34購自美國eBioscience公司。

2 方法與結果

2.2 MDSC分離與培養 將2周齡C57BL/6小鼠CO2窒息處死，置于75%乙醇中浸泡消毒15 min，置于超凈臺，將表面皮膚脫套樣分離，剪除四肢骨骼肌周圍脂肪組織，仔細剝離神經、血管，眼科剪剪取四肢骨骼肌，沿肌肉長軸剪碎，以利于組織消化。將剪碎的肌肉組織置于IMDM培養基中，轉移至細胞培養室。依次置于0.1% Ⅰ型膠原酶90 min、1.2 U/mL中性蛋白酶45 min、0.1% EDTA胰蛋白酶30 min消化，將得到的混懸液依次置于100、200、300、400目細胞篩過濾，濾后的細胞以1 000 r/min離心5 min，去上清，加入IMDM培養基、bFGF 12.5 ng/mL、EGF 0.4 ng/mL、IGF 20 ng/mL、20% FBS、1%雙抗(成纖維細胞培養基)，置于37 ℃、5% CO2的培養箱中進行分離培養(pp0時段)。2 h后(pp1時段)，取上清液，離心，加入新鮮成纖維細胞培養基培養。之后每24 h取上清液離心，加入MDSC增殖培養液(IMDM 10 ng/mL、bFGF 10 ng/mL、EGF 20 ng/mL、PDGF 10 ng/mL、10% FBS、10% HS、0.5% CEE、1%雙抗)培養，共5次(分別設為pp2、pp3、pp4、pp5和pp6時段)。顯微鏡下觀察各時段懸浮細胞形態變化并計數，繪制細胞生長曲線。

顯微鏡下可見，細胞接種后5 min即開始貼壁；24 h時貼壁細胞以成纖維細胞形態為主，呈長梭形、核大、折光率低；pp2時段開始時仍有部分細胞貼壁，但懸浮細胞數量逐漸增多，細胞呈小球形，單個或成團，表面光滑，折光率高，懸浮細胞未見明顯細胞融合或收縮現象。至pp3、pp4、pp5時段懸浮細胞保持小球形，體積逐漸增大，數量逐漸增多，呈單個或小團簇狀聚集。pp6時段細胞量最多，細胞聚集成團，團內細胞保持小球形、高折光率狀態。細胞計數結果顯示，pp2、pp3、pp4、pp5和pp6時段懸浮細胞數量依次增多，分別為(2.64±0.20)×105、(3.08±0.19)×105、(3.63±0.13)×105、(4.64±0.15)×105、(6.06±0.26)×105個，各時段懸浮細胞數量兩兩比較P均<0.05。

2.3 MDSC表面標記物檢測 收集pp2～pp6時段培養上清液(含懸浮細胞)，1 000 r/min離心5 min，去上清；流式分析緩沖液吹打重懸，300目細胞篩過濾，1 000 r/min離心5 min，去上清；加入100 μL流式分析緩沖液重懸細胞團，再加入CD34、Sca-1直標抗體，并設不加抗體的對照組，充分混勻后室溫避光反應30 min；加1 mL緩沖液，1 000 r/min離心5 min，去上清，加入200 μL緩沖液重懸細胞團；流式細胞儀檢測CD34、Sca-1陽性細胞所占比例。結果顯示，CD34+、Sca-1+、CD34++Sca-1+細胞所占比例隨培養時間延長均逐漸增加(P均<0.05)。見表1。

表1 各時段CD34+、Sca-1+、CD34++Sca-1+細胞比例(%)

2.4 MDSC成神經誘導分化 骨骼肌取材同時取坐骨神經，置于培養基中，1 000 r/min離心5 min，去上清，加入NB4I酶溶液4 mL、0.2% Dispase Ⅱ溶液2 mL，振蕩消化90 min；1 000 r/min離心5 min，去上清，加入施萬細胞培養基(bFGF 10 ng/mL、heregnlin-β110 ng/mL、Forskolin 2 mol/L、10% FBS、低糖DMEM)7 mL，吹打重懸，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，每3天換液一次，1周后傳代純化培養，留取上清液備用。取懸浮培養pp6時段細胞1 000 r/min離心5 min，去上清，加入施萬細胞培養上清液，每3天換液一次，拍照記錄細胞形態變化，免疫熒光檢測誘導細胞p75 NGF表達。結果顯示，施萬細胞誘導培養7天，光鏡下見小球形、高折光率細胞逐漸分化為長條形、串珠樣類施萬細胞，部分細胞死亡，部分仍保持小球形。免疫熒光顯示，約90%的誘導細胞p75 NGF受體反應陽性，說明分離培養的細胞具有良好的成神經誘導能力。

2.5 MDSC成骨誘導分化 取懸浮培養的pp6時段細胞1 000 r/min離心5 min，去上清，加入成骨誘導液(維生素C 50 mg/L、甘油磷酸 10 mmol/L、地塞米松 100 nmol/L、10% FBS、DMEM)，每3天換液一次，拍照記錄細胞形態變化，并進行茜素紅染色。結果顯示，誘導培養21天，光鏡下可見小球形折光率高的細胞大量分化為長條形細胞，部分顯示片狀，有晶體形成。茜素紅染色大部分紅染，并可見棕褐色結晶狀礦化結節形成。表明分離培養的細胞有良好的成骨分化能力。

3 討論

MDSC作為一種成體干細胞，具有多向分化能力，不僅可在正常條件下通過細胞融合形成肌管，在特定誘導條件下還可分化為中胚層其他類型細胞，甚至外胚層細胞[3]，如內皮細胞、脂肪細胞、骨細胞、神經細胞等。MDSC其作為組織工程研究的種子細胞和基因治療的轉染細胞，目前已被用于多種疾病的治療[4～7]。

1970年Richler等[8]采用胰蛋白酶消化培養法獲取MDSC，之后學者們陸續改進了MDSC的提取步驟，目前主要采用聯合消化酶法，并取得了較好效果。骨骼肌是MDSC的主要來源。肌源性干細胞的提取與培養已在多種動物中得以應用。目前比較成熟的方法為骨骼肌機械分離與多步酶消化法。骨骼肌機械分離過程采用眼科剪將肉眼可見的血管、神經、脂肪剔除，剪取骨骼肌，并將骨骼肌初步剪碎，有利于后續的酶消化。剪碎過程中應注意盡量沿肌纖維走行方向，減少肌纖維碎片混入。取下的骨骼肌碎塊采取多步酶消化法，首先是膠原酶，由于膠原酶分為不同類型(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型)，按照骨骼肌中結締組織的類型，我們選擇Ⅰ型膠原酶。膠原酶本身屬于一種蛋白質，可以解離纖維結締組織，分散肌纖維，使之成為單根肌纖維，以利于之后中性蛋白酶和胰蛋白酶消化。在消化振蕩過程中應注意觀察組織分解情況。之后加入中性蛋白酶，其屬于一種內切酶，可水解蛋白質，使組織消化更徹底。最后加入EDTA胰蛋白酶消化，可將細胞間蛋白質水解，繼而達到分散細胞的目的。使用胰蛋白酶過程中，應掌握好濃度、溫度和時間，實驗過程不超過30 min，胰蛋白酶作用較強，如果濃度較高或作用時間太長易致細胞死亡。

MDSC的體外擴增能力與所用培養基及血清等密切相關。FBS的質量和濃度可直接影響MDSC增殖。采用優質FBS與馬血清有利于細胞增殖，延緩細胞分化。FBS濃度過高或過低均易導致細胞融合及其向肌管分化[9]，然而其適宜濃度尚未明確，本研究選取應用較普遍的10% FBS。CEE在肌肉來源細胞培養過程中的作用十分重要。CEE含有大量刺激或抑制細胞周期的成分，不同廠家和不同批次CEE質量也有差異，可能影響MDSC的培養過程。值得注意的是，CEE在使用過程中不應進行離心和超濾，經過超濾的CEE效價會降低[10]。

MDSC的自我更新能力較低，目前MDSC的分離方法主要有差速貼壁法、密度梯度離心法、流式細胞分選法和免疫磁珠分選法等[11]。差速貼壁法是各國實驗室最常用的方法，已成功分離培養出不同種屬動物的MDSC。其優勢為操作簡單，可獲得純度相對較高的MDSC。但在實際操作過程中發現，該方法分離培養的MDSC擴增數量有限，約80%慢貼壁細胞在第1周保持靜默狀態，這些靜默狀態的慢貼壁細胞僅有極少量會在接下來的2周內增殖，僅在培養瓶中形成小的克隆集落[10]。既往MDSC的培養均采用2D貼壁培養法，而實驗室獲取的細胞均是從正常的3D組織生長條件下分離而來的，這種非生理培養條件必然會改變細胞行為，進而限制細胞的體外擴增與分化潛能[12]。MDSC不僅具有自我更新和分化能力，還具有間隙連接細胞通訊缺陷、接觸不敏感生長及非貼附性生長的特點。在其他類型的間充質干細胞，如人脂肪源性干細胞和人骨髓源性干細胞中，約50%可以在軟瓊脂中形成克隆集落[12]。上述研究均證實，MDSC有能力進行非貼附性生長。研究者們將細胞以懸浮球模式培養，使細胞在類似于組織內的三維環境中排列生長。由于腫瘤的懸浮球與原位實體腫瘤十分相似，因此這種懸浮培養技術目前主要應用于腫瘤研究。與傳統的單層細胞培養相比，懸浮培養可模擬細胞在機體內的三維環境，對維持培養細胞的干性和分化潛能十分重要。

因MDSC具有不易貼壁的特性，故本課題組嘗試采用懸浮培養法對原代MDSC進行培養。從細胞計數和光鏡下觀察來看，細胞數量隨培養時間延長而增加，且逐漸形成一個個細胞團，團內可見較多小球形、折光率高的正常細胞，顯示出較好的自我更新能力。證實懸浮培養法可得到相當數量的MDSC，且在細胞收集過程中不需采用胰蛋白酶，有利于保持細胞的原始特性。

MDSC作為一個細胞群體，目前尚沒有特異性的表面標記物。CD34與Sca-1是目前已知的MDSC表達較高的表面標記物[13，14]。CD34是一種高度糖基化Ⅰ型跨膜蛋白，選擇性表達于造血干、祖細胞等表面，隨干細胞分化而表達逐漸減少，CD34+細胞所占比例升高一定程度上說明干細胞所占比例增加。Sca-1是小鼠造血干細胞的標志分子，幾乎可在所有器官、組織干細胞中表達。CD34和Sca-1作為表達量相對較高的干性因子已為大多數研究者所公認。但由于各國實驗室的實驗條件、實驗步驟和材料等差異，細胞缺乏具有一致共識的表面蛋白或標記物，使得直接進行其表面標記物表達量的比較(即純度比較)難以進行，而且一些標記物(尤其是表面蛋白)可以在體外因各種原因上調或下調，讓情況更加復雜。本研究流式檢測結果顯示，細胞隨培養時間延長，CD34與Sca-1陽性細胞所占比例逐漸增多，提示干性細胞數量逐漸增加。但出現上述結果是否為懸浮培養過程中雜細胞不斷貼壁導致純度增加所致，仍需要進一步驗證。

除表面標記物的檢測外，干細胞的鑒定同樣取決于細胞的形態和分化能力。在體外基本培養條件下，MDSC可自發分化為肌管[15]。本研究采用表面標記物檢測與誘導分化同時進行的方法驗證懸浮培養MDSC的分化潛能，證實MDSC發生了自發分化，形成了高、亮、粗長條形的肌管，并具有收縮性，這種自發分化的情況可能與培養基中血清含量過高，模擬了體內的再生過程所致[9]。德國學者采用與我們類似的動態支持培養方法發現，MDSC在懸浮狀態下易分化，可能是這種連續增殖的細胞表達了特定的表面標記物，而這種表面特性可以造成沒有或先于細胞融合的終末分化[16]。研究發現，當以誘導因子刺激時，MDSC顯示出強大的分化能力，可分化為中、外胚層的各種類型細胞[7]；將MDSC移植入坐骨神經嚴重受損的小鼠體內后，其不僅可以分化為施萬細胞，還可向神經束膜/神經內膜細胞分化，分別形成髓鞘和神經束膜/內膜，包繞再生的軸突，促進斷端神經再生[17]。鑒于成熟的施萬細胞可分泌各種神經生長因子、營養因子等，模擬體內MDSC的分化條件，本研究選擇以施萬細胞條件培養液進行誘導分化，將所獲得的pp6時段懸浮細胞進行成神經誘導。結果顯示，誘導后細胞由小球形、高折光率細胞逐漸分化為長條形，部分細胞可見串珠狀的類施萬細胞樣外觀，免疫熒光染色顯示p75 NGF受體反應陽性。成骨誘導的細胞在培養1周左右開始由小球形細胞變為長條形，至培養2～3周約90%細胞變為長條形，且細胞顏色加深，茜素紅染色大部分紅染。證實MDSC具有向中、外胚層細胞分化的能力。

綜上所述，懸浮培養法可獲取初始細胞量約3倍的小鼠MDSC，且培養獲得細胞具有良好的成神經、成骨分化能力。