口腔鱗癌組織LATS2基因啟動子甲基化水平及其意義

韋存志，肖世強，王建洪，毛曉斌，陳雷

(宜賓市第一人民醫院，四川宜賓644000)

近年研究發現，大腫瘤抑制因子2(LATS2)表達受抑可能與癌癥的發生、發展密切相關[1,2]。口腔鱗狀細胞癌(口腔鱗癌)組織中LATS2基因表達明顯下調或基因失活，但其具體原因尚不清楚[3]。DNA甲基化是指在甲基轉移酶的催化下，DNA C、G兩個核苷酸的胞嘧啶被選擇性地添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶。DNA甲基化能引起染色質結構、DNA構象、DNA穩定性及DNA與蛋白質相互作用方式的改變，可導致腫瘤的發生及發展。LATS2基因啟動子區高甲基化可導致LATS2基因失活，進而導致腫瘤發生[4]。本研究探討LATS2基因啟動子甲基化在口腔鱗癌發生、發展中的作用?，F報告如下。

1 臨床資料

選取2013年2月～2017年8月宜賓市第一人民醫院收治的口腔鱗癌患者108例，男63例、女45例，年齡27～84(59.6±10.3)歲，均行手術切除腫瘤，術后病理檢查證實診斷。腫瘤臨床分期(2002年國際抗癌聯盟TNM分期標準)：Ⅰ、Ⅱ期59例，Ⅲ、Ⅳ期49例；組織分級：Ⅰ級51例，Ⅱ級33例，Ⅲ級24例；有淋巴結轉移45例，無淋巴結轉移63例。所有患者術前未行放療或化療，相關臨床病理資料完整。本研究經宜賓市第一人民醫院醫學倫理委員會批準，患者或其家屬均知情同意。

2 方法與結果

2.2 口腔鱗癌組織及癌旁正常組織LATS2 mRNA表達檢測 采用RT-PCR法。取108例患者手術切除的口腔鱗癌組織及其中45例患者癌旁正常組織。采用TRIzol法提取組織總RNA，逆轉錄為cDNA，采用ABI Fast7500熒光定量PCR儀進行PCR擴增。引物序列：LATS2上游引物5′-GCTTCATCCACCGAGACATCAA-3′，下游引物5′-CGACAGTTAGACACATCATCCCAGA-3′；GAPDH上游引物5′-CCCCTTCATTGACCTCAACTACAT-3′，下游引物5′-CGCTCCTGGAAGATGGTGA-3′。根據PCR擴增試劑盒說明配制反應體系。反應條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40個循環；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。采用2-ΔΔCt法計算LATS2 mRNA相對表達量。PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳觀察，出現LATS2條帶判定為LATS2 mRNA陽性表達，未出現此條帶即為LATS2 mRNA表達缺失。結果顯示，口腔鱗癌組織及癌旁正常組織LATS2 mRNA陽性表達率分別為47.22%(45/108)、100%(45/45)，LATS2 mRNA相對表達量分別為0.32±0.04、1.01±0.08，二者比較P均<0.05。

2.3 口腔鱗癌組織LATS2基因啟動子甲基化檢測 采用特異性PCR(MSP)法。參照文獻[5]方法進行模板DNA提取及硫化修飾。MSP亞硫酸氫鹽修飾DNA分別經甲基化與非甲基化引物擴增。引物序列：甲基化上游引物5′-TTTAAAGATCGAAACGAGGGAGCG-3′，下游引物5′-CCCAACGAAAAAACCCGACTAACG-3′；非甲基化上游引物5′-TTTTTTAAAGATTGAAATGAGGGAGTG-3′，下游引物5′-AAACCCAACAAAAAAACCCAACTAACA-3′。根據PCR擴增試劑盒說明配制反應體系。反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共30個循環；最后72 ℃延伸7 min。PCR產物于2%瓊脂糖凝膠電泳觀察。結果判斷標準[6]：僅擴增出甲基化產物特異性條帶，判定為完全甲基化；僅擴增出非甲基化特異性條帶，判定為完全非甲基化；同時擴增出甲基化和非甲基化特異性條帶，判定為部分甲基化。完全甲基化和部分甲基化均判定為甲基化。結果顯示，口腔鱗癌組織LATS2基因啟動子完全甲基化率高于癌旁正常組織，完全非甲基化率低于癌旁正常組織，二者比較P均<0.05。見表1。

表1 口腔鱗癌組織及其癌旁正常組織LATS2基因啟動子甲基化情況比較[例(%)]

注：與癌旁正常組織比較，*P<0.05。

2.4 口腔鱗癌組織LATS2基因啟動子甲基化與患者臨床病理參數的關系 見表2。

表2 口腔鱗癌組織LATS2基因啟動子甲基化與患者臨床病理參數的關系(例)

2.5 口腔鱗癌組織LATS2基因啟動子甲基化與其mRNA表達的關系 57例LATS2基因表達缺失的口腔鱗癌組織中，51例出現LATS2基因啟動子甲基化；51例有LATS2基因表達的口腔鱗癌組織中，22例出現LATS2基因啟動子甲基化。相關分析顯示，口腔鱗癌組織LATS2基因啟動子甲基化與LATS2 mRNA表達呈負相關關系(r=-0.734，P<0.01)。

3 討論

LATS2定位于13q11-12，參與細胞微管蛋白和紡錘體形成，調控細胞周期，可通過多條信號通路參與抑制惡性腫瘤細胞增殖及凋亡[7,8]。在多種腫瘤中發現LATS2基因轉錄和翻譯異常，且其表達與腫瘤的惡性程度呈負相關關系[9,10]。陶峰等[11]研究發現，宮頸鱗癌組織LATS2表達顯著低于癌旁正常組織，LATS2表達降低與腫瘤大小及有無淋巴結轉移明顯相關。雷靜等[12]研究發現，LATS2基因在上皮性卵巢癌組織中的表達量顯著低于良性卵巢腫瘤組織和正常卵巢組織，且與組織分化程度及有無淋巴轉移相關。本研究結果顯示，口腔鱗癌組織LATS2 mRNA表達顯著低于癌旁正常組織，與上述文獻報道一致，說明LATS2基因表達受到抑制與口腔鱗癌的發生、發展有關。

在腫瘤表觀遺傳學研究中，以對DNA甲基化的研究最為深入。抑癌基因啟動子高甲基化將導致抑癌基因沉默及轉錄抑制，進而促進腫瘤的發生[13]。抑癌基因DNA甲基化作為某些惡性腫瘤的分子診斷標志物，其敏感性和可操作性均優于目前的分子生物標志物。近年研究發現，口腔鱗癌患者存在某些抑癌基因異常甲基化現象[14]。Jiang等[15]對星形膠質細胞瘤研究發現，LATS2基因啟動子甲基化可導致LATS2基因表達下調。本研究結果顯示，口腔鱗癌組織LATS2基因啟動子區甲基化發生率明顯高于癌旁正常組織，且LATS2基因啟動子甲基化與LATS2 mRNA表達呈負相關關系。提示LATS2基因啟動子甲基化致其基因表達受到抑制在口腔鱗癌患者中是一個高發現象，可能是口腔鱗癌的發病機制之一。本研究結果顯示，臨床分期高、組織分級低、有淋巴轉移的口腔鱗癌患者LATS2基因啟動子甲基化發生率更高；說明LATS2基因甲基化頻率越高，腫瘤惡性程度越高，發生侵襲和轉移的概率越大。有研究表明，LATS2基因可下調抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-x從而激活凋亡蛋白酶9，促進細胞凋亡[16]；LATS2基因可直接或間接抑制細胞周期蛋白依賴性激酶2，促使細胞周期停滯在G1/S期，抑制細胞增殖[17]。LATS2基因發生啟動子高度甲基化可能通過以上相關分子機制促進口腔鱗癌的發生、發展，這有待于進一步研究證實。

綜上所述，LATS2基因啟動子甲基化可通過下調LATS基因表達促進口腔鱗癌的發生、發展。