膀胱癌組織SENP1表達變化及其臨床意義

楊旭東，陳曉，張勇

(1首都醫科大學附屬北京天壇醫院，北京100050；2北京大學腫瘤醫院)

晚期膀胱癌由于喪失了手術時機，而且對傳統放化療不敏感，患者往往預后較差。分子靶向治療是目前腫瘤治療的熱點。血管內皮生長因子(VEGF)信號傳導通路是腫瘤血管生成、腫瘤生長及轉移的關鍵限速步驟，故目前開發的抗腫瘤血管生成藥物多以VEGF為靶點。舒尼替尼、帕唑帕尼和貝伐珠單抗是目前臨床常用的靶向治療藥物，對腎癌、結直腸癌及肺癌等均具有良好的治療效果[1～3]。但其對膀胱癌的治療效果仍不明確，可能存在腫瘤血管生成調控通路的上游或旁路調控因子影響靶向藥物的敏感性。缺氧是惡性實體腫瘤的一個重要特征[4，5]。缺氧誘導因子1α(HIF-1α)在缺氧細胞中活性增強，其作為VEGF的上游調控因子，能夠激活VEGF的轉錄活性，從而促進腫瘤血管生成[6，7]。有研究證實，HIF-1α及VEGF均可參與膀胱癌血管生成[8]。在缺氧狀態下，SUMO特異性蛋白酶1(SENP1)可通過調控HIF-1α的小泛素化修飾，保證其在腫瘤細胞中高表達與高活性[6]；但SENP1又是HIF-1α及VEGF的重要上游調控因子。由此推測，SENP1可能在膀胱癌腫瘤血管生成中具有重要作用。本研究觀察了膀胱癌組織SENP1表達變化，并分析其與HIF-1α、VEGF表達及患者臨床病理參數的關系，旨在探討其在膀胱癌發生、發展中的作用及其機制。現報告如下。

1 臨床資料

選擇2008年5月～2016年3月在北京大學腫瘤醫院接受手術治療的膀胱癌患者130例。所有患者經術后組織病理檢查明確診斷。其中，男76例、女54例，年齡26～83(54.9±11.7)歲；2004年WHO膀胱腫瘤病理分級：低度惡性傾向22例，低級別57例，高級別51例；2002年UICC膀胱癌臨床分期：T1期96例，T2期30例，T3期4例；生長方式：浸潤性生長59例，非浸潤性生長71例；發病狀態：初發87例，復發43例。本研究經北京大學腫瘤醫院醫學倫理委員會批準，患者或其家屬均知情同意。

2 方法與結果

2.1 統計學方法 采用SPSS20.0統計軟件。計數資料比較采用χ2檢驗或確切概率檢驗。相關性分析采用Spearman相關分析法。P<0.05為差異有統計學意義。

2.2 膀胱癌組織SENP1、HIF-1α、VEGF表達檢測 取手術切除的膀胱癌組織130例份及其相應的癌旁組織(距腫瘤邊緣>1 cm，并經病理檢查證實為正常組織)80例份。所有組織標本經4%甲醛固定12 h，梯度乙醇逐級脫水，石蠟包埋，4 μm厚切片。切片經二甲苯浸泡脫蠟，梯度乙醇水化，95 ℃檸檬酸鹽修復液修復抗原。自然冷卻至室溫，3%過氧化氫孵育10 min，封閉內源性過氧化物酶。山羊血清封閉2 h，阻斷組織與一抗的非特異性結合。然后分別加入兔抗人單克隆SENP1抗體(稀釋比1∶100)、兔抗人單克隆HIF-1α抗體(稀釋比1∶200)小鼠抗人單克隆VEGF抗體(稀釋比1∶200)，4 ℃孵育過夜。次日加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗或山羊抗小鼠IgG二抗(稀釋比均為1∶50)，室溫孵育30 min。DAB顯色，自來水沖洗，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對照。采用雙盲法由兩位病理科主任醫師獨立閱片。結果判定：SENP1、HIF-1α陽性染色定位于細胞核或細胞質，呈棕黃色顆粒，VEGF陽性染色定位于細胞質，呈棕黃色顆粒。每張切片隨機選取5個400倍視野，評估陽性染色程度；計數200個細胞，計算陽性細胞比例。染色程度評分：淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分；陽性細胞比例評分：≤10%計1分，>10%～50%計2分，>50%～80%計3分，>80%計4分。SENP1、HIF-1α、VEGF陽性表達以染色程度計分和陽性細胞比例計分綜合判定，二者評分之和>3分為陽性表達[9]。結果顯示，膀胱癌組織及癌旁正常組織SENP1陽性表達率分別為59.23%(77/130)、11.25%(9/80)，二者比較P<0.01。

2.3 膀胱癌組織SENP1、HIF-1α、VEGF表達與患者臨床病理參數的關系 見表1。

表1 膀胱癌組織SENP1、HIF-1α、VEGF表達與患者臨床病理參數的關系

注：由于臨床分期T2、T3期數較少，統計結果為這兩期合并后與T1期的比較。

2.4 膀胱癌組織SENP1表達與HIF-1α、VEGF表達的關系 Spearman相關分析顯示，膀胱癌組織SENP1陽性表達與HIF-1α、VEGF陽性表達均呈正相關關系(r分別為0.338、0.494，P均<0.01)。

3 討論

持續廣泛的新生血管生成是惡性腫瘤無限制侵襲性生長的基礎[10，11]。VEGF和HIF-1α是促進惡性腫瘤血管生成最重要的生長因子。VEGF是一種高度特異性的血管內皮細胞有絲分裂素，通過與其特異性受體結合，引起一系列信號傳導，刺激血管內皮細胞增殖和血管通透性增加，從而促進新生血管生成[12]。HIF-1是一種異質二聚體蛋白質復合物轉錄因子，HIF-1α是其功能亞基，也是惟一的氧分子調節亞單位，決定著HIF-1的活性。HIF-1α能夠調控包括VEGF、胎盤生長因子及血小板源性生長因子等促進血管生成的因子[13]。由于腫瘤組織血管生成過程中促血管生成因子表達過剩，導致腫瘤血管無論是在結構上還是在功能上均不正常[14]。因此，盡管腫瘤組織血管豐富，但其灌注不平衡、氧供不充分；缺氧狀態能夠促進HIF-1α活性，而通過靶向藥物抑制VEGF介導的血管生成，可加重腫瘤組織微環境的缺氧狀態并促進HIF-1α活性，進一步激活其他下游靶基因，從而導致腫瘤進展及耐藥[15]。

SENP1是一類調控SUMO修飾逆反應的酶蛋白家族重要成員[16]。SUMO是廣泛存在于真核生物中高度保守的類泛素蛋白，可通過與底物蛋白共價連接可逆性修飾靶蛋白，具有調節靶蛋白細胞定位和功能的作用[17]。在缺氧狀態下，SENP1的去SUMO化作用能增加HIF-1α的穩定性及轉錄活性[6]，其作用機制：一方面由于蛋白酶體活性受到抑制，HIF-1α不能像在常氧狀態下通過依賴蛋白酶體的途徑降解；另一方面，缺氧可促使HIF-1α向細胞核內移位，并促使其發生SUMO化。實際上，SUMO修飾提供了另一種信號，促使HIF-1α與VHL結合并發生泛素修飾，從而介導SUMO修飾后的HIF-1α降解。但通常情況下，缺氧誘導產生的SUMO化大多能被SENP1去SUMO化，從而維持HIF-1α在缺氧條件下的穩定性及轉錄活性。此外，SENP1還是HIF-1α的調控靶基因，二者之間的正反饋作用能夠提高肝癌的干細胞特性并促進肝癌發生[18，19]。在前列腺癌組織中SENP1高表達，并與前列腺癌的侵襲和復發有關；抑制高級別轉移性前列腺癌細胞中SENP1表達，可影響HIF-1α及其信號通路中下游MMP-2、MMP-9的骨重構能力，進而抑制前列腺癌細胞骨轉移[20]。在骨肉瘤細胞中同樣檢測到SENP1表達，在缺氧條件下SENP1通過調控HIF-1α表達，促進骨肉瘤細胞增殖、侵襲及上皮間質轉化[21]；而通過調控HIF-1α表達，可使SENP1誘發卵巢癌對鉑類化療藥物耐藥[22]。上述研究表明，SENP1能夠通過調控HIF-1α在惡性腫瘤的發生、進展中發揮重要作用。

本研究結果顯示，膀胱癌組織SENP1陽性表達率明顯高于癌旁正常組織，提示膀胱癌的發生與SENP1有關。本研究中低度惡性潛能與低級別膀胱癌組織SENP1陽性表達率比較無明顯統計學差異，但低度惡性潛能及低級別膀胱癌組織SENP1陽性表達率均明顯低于高級別膀胱癌組織，提示SENP1可能在膀胱癌的進展中發揮作用。本研究結果顯示，臨床高分期(T2、T3期)、浸潤性生長及復發狀態的膀胱癌患者癌組織SENP1陽性表達率均明顯高于臨床低分期(T1期)、非浸潤性生長及初發狀態者，其HIF-1α、VEGF陽性表達率亦呈上述趨勢，提示SENP1及HIF-1α、VEGF均參與了膀胱癌的進展。本研究相關分析發現，膀胱癌組織SENP1陽性表達與HIF-1α、VEGF陽性表達均呈正相關關系，提示SENP1促進膀胱癌進展可能與調控HIF-1α及其下游的VEGF有關。

綜上所述，膀胱癌組織SENP1高表達可促進膀胱癌的發生及發展，其機制可能與上調HIF-1α、VEGF表達有關。