miR-146a對肺纖維化小鼠成纖維細胞增殖的影響及其機制

石宇紅，任亞飛，蔣亞男，許佳，李寶貞，朱芳曉，莫漢有

(桂林醫學院附屬醫院，廣西桂林541002)

肺纖維化是以成纖維細胞增殖及大量細胞外基質聚集并伴炎癥損傷、組織結構破壞為特征的一大類肺疾病終末期改變，其發病機制尚不完全清楚。研究表明，轉化生長因子β1(TGF-β1)在肺纖維化的發生、發展中具有重要作用[1,2]；核因子κB(NF-κB)可通過調節TGF-β1分泌影響肺纖維化進程[3]。微小RNA(miRNA)是一類長度約為22 nt的單鏈非編碼小分子RNA，可通過抑制靶基因翻譯參與多種重要的生物學過程。miR-146a是miRNA家族成員之一，在NF-κB信號通路中具有負性調控作用，可通過抑制腫瘤壞死因子受體相關因子6、IL-1受體相關激酶1、母親DDP同源物蛋白(Smad)等表達而調控NF-κB信號通路[4]。2016年2月～2017年11月，我們觀察了miR-146a對肺纖維化小鼠肺成纖維細胞增殖的影響，并探討其在肺纖維化發生、發展中的作用機制。現報告如下。

1 材料

雄性C57BL/6小鼠30只，SPF級，體質量20～26 g，由桂林醫學院實驗動物中心提供。RNA反轉錄試劑盒和SYBR Green Realtime PCR Master Mix試劑盒、LipofectamineTM2000轉染試劑，瑞士Roche公司；博來霉素，日本化藥株式會社；miR-146a引物、miR-146a mimics(miR-146a激活劑)、miR-146a陰性對照物、β-actin引物，上海捷瑞生物工程有限公司；鼠α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)單克隆抗體，武漢博士德生物工程有限公司。Masson染色試劑盒，南京建成生物工程研究所；Western blotting試劑盒，上海拜力生物科技有限公司；RT-PCR試劑盒，大連寶生物工程有限公司。

2 方法與結果

2.2 肺纖維化組織miR-146a表達檢測

2.2.1 肺纖維化模型制作 將30只小鼠按照隨機數字表法分為假手術組和模型組，每組15只。兩組均給予1%氯胺酮(100 mg/kg)腹腔內注射麻醉，無菌條件下鈍性分離并暴露氣管，模型組一次性向氣管內滴入博來霉素3.5 mg/kg，假手術組在相同條件下滴入等體積生理鹽水，滴完后將小鼠直立并旋轉5 min。造模后第28天，兩組均給予1%氯胺酮100 mg/kg腹腔注射麻醉，腹主動脈放血后處死，完整分離肺臟，去除結締組織，將左肺組織迅速放入-80 ℃液氮中凍存，以備提取肺組織總RNA；將右肺組織迅速置于40 g/L甲醛中固定24 h，石蠟包埋，切片，分別行HE染色和Masson染色。HE染色結果顯示，假手術組肺泡結構正常，偶見炎性細胞浸潤；模型組肺泡結構紊亂，肺泡間隔內可見大量纖維細胞，纖維組織片狀或條索狀增生，肺泡間隔消失或斷裂。Masson染色結果顯示，模型組可見大量綠色的膠原纖維堆積，膠原纖維增生。上述結果提示，肺纖維化模型制備成功。

2.2.2 肺纖維化組織miR-146a表達檢測 采用RT-PCR法。取出液氮中凍存的左肺組織，采用TRIzol法提取肺組織總RNA，經瓊脂糖凝膠電泳、紫外分光光度計鑒定，提取的總RNA純度及濃度合格。將總RNA逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增。引物由美國Invitrogene公司設計合成，miR-146a上游引物為5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAACCCATG-3′，下游引物為5′-ACACTCCAGCTGGGTGAGAACTGAATTCC-3′；U6 上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反應體系共20 μL，包括上下游引物各0.4 μmol/L，Taqman熒光探針0.2 μmol/L，2×Taqman universal PCR Mastermix 10 μL，cDNA 1 μL(相當于0.1 μg RNA)，補水至20 μL。反應條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s、62 ℃ 1 min(45個循環)。以U6作為內參，采用標準曲線法計算miR-146a相對表達量。結果顯示，模型組及假手術組肺組織miR-146a相對表達量分別為(2.06±0.52)×10-4、(7.25±0.36)×10-4，兩組比較P<0.01。

2.3 miR-146a過表達對肺纖維化細胞增殖及NF-κB信號通路相關因子表達的影響

2.3.1 肺成纖維細胞培養及鑒定 取造模第28天模型組肺組織，無菌條件下用眼科剪剪為1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，采用組織塊培養法進行成纖維細胞原代培養。HE染色觀察細胞形態學特征，可見梭形成纖維細胞排列緊密，細胞核為規則卵圓形，核仁大而明顯，胞質透明，并彼此連接成網狀。采用免疫細胞化學染色方法檢測波形蛋白、肌動蛋白表達，結果顯示肌動蛋白陰性、波形蛋白陽性，符合成纖維細胞免疫表型特點。

2.3.2 過表達miR-146a的肺成纖維細胞模型建立 將成纖維細胞接種于6孔板，調整細胞密度為1×105個/孔。隨機將細胞分為miR-146a過表達組、對照組、空白組，每組5個復孔。當細胞融合至50%左右時，miR-146a過表達組加入5 μL LipofectamineTM2000轉染試劑和6 μL miR-146a mimics，對照組加入5 μL LipofectamineTM2000轉染試劑和6 μL miR-146a陰性對照物，空白組加入等體積緩沖液。三組均于培養箱中轉染24 h，完全培養基中止轉染，再培養36 h，收集細胞，采用RT-PCR法檢測miR-146a表達，具體步驟參照2.2.2。結果顯示，miR-146a 過表達組miR-146a相對表達量為(7.53±0.68)×10-4，對照組為(1.32±0.12)×10-4，空白組為(1.17±0.25)×10-4；miR-146a過表達組高于其他兩組(P均<0.05)，而空白組與對照組比較P>0.05。提示過表達miR-146a的成纖維細胞模型建立成功。

2.3.3 過表達miR-146a的成纖維細胞增殖率檢測 采用CCK-8法。取三組轉染24 h再培養36 h的對數生長期成纖維細胞，以2×107個/孔密度接種于96孔板，每孔加入15 μL CCK-8溶液，飽和濕度孵育箱中培養2 h。采用酶標儀測定460 nm波長處的吸光度(A460)值，計算細胞增殖率。結果顯示，miR-146a 過表達組細胞增殖率為(13.47±1.83)%，對照組為(33.87±1.32)%，空白組為(32.57±1.54)%， miR-146a過表達組低于其他兩組(P均<0.05)，而空白組與對照組比較P>0.05。

2.3.4 過表達miR-146a的成纖維細胞NF-κB信號通路相關因子表達檢測 采用Western blotting法。取三組轉染24 h再培養36 h的對數生長期成纖維細胞，按RIPA試劑盒說明書提取蛋白，經BCA法蛋白定量合格。取部分蛋白行10% SDS-PAGE，采用半干轉電轉移法將凝膠中蛋白轉至硝酸纖維素膜。轉膜后將硝酸纖維素膜置于5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入TGF-β1、NF-κB p65一抗(工作液濃度分別為1∶100、1∶750)，4 ℃孵育過夜，ECL顯色。凝膠成像系統掃描分析，PhotoshopCS5.0軟件檢測各組條帶灰度值，以GAPDH作為內參，計算TGF-β1蛋白相對表達量；以β-actin、LaminB1作為內參，分別計算NF-κB p65及核因子κB 抑制蛋白α(IκBα)蛋白相對表達量。實驗重復3次，結果取平均值。結果顯示，與對照組和空白組比較，miR-146a過表達組TGF-β1、IκBα蛋白相對表達量均降低(P<0.05)，NF-κB p65蛋白相對表達量增高(P<0.05)，而空白組與對照組比較P>0.05。見表1。

表1 三組TGF-β1、NF-κB p65及IκBα蛋白相對表達量比較

注：與空白組比較，*P<0.05；與對照組比較，△P<0.05。

3 討論

肺成纖維細胞活化是肺纖維化發生和發展過程中的核心環節和關鍵步驟[5]。當肺成纖維細胞受到致纖維化因子刺激時，其表型發生轉化，轉化為肌成纖維細胞，后者可表達α-SMA，合成大量膠原，細胞外基質合成增多、降解減少導致異常沉積，誘導肺泡上皮細胞發生凋亡，促進肺纖維化的發生和發展[6～8]。TGF-β1是肺纖維化進程中的關鍵性細胞因子，是纖維化發生與發展的啟動因子，能啟動成纖維細胞的增殖和分裂過程[9]；TGF-β1還能促進成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞[10]，并分泌大量細胞外基質及膠原，誘導肺纖維化的發生及發展[11]。研究證實，TGF-β1的合成受NF-κB調控[12]。NF-κB屬于真核細胞核轉錄因子家族成員，p65是其主要的功能亞單位[13]。NF-κB在非活化狀態存在于細胞質中，與多種基因啟動子或增強子部位的κB位點特異性結合后被活化，其活化后發生核轉位，從細胞質轉移至細胞核，參與TGF-β1合成[14]。IκBα是NF-κB的負性調節劑，增加IκBα的合成或抑制其降解可抑制NF-κB活性[15]。通過采用腺病毒攜帶IκB基因轉染呼吸道上皮細胞，可促進細胞表達IκB，抑制NF-κB活化，調節TGF-β1分泌[16]。

miRNA是一類小分子編碼RNA，通過使靶基因降解或阻止其翻譯轉錄負向調控或沉默靶基因表達。研究發現，miR-146a參與炎癥調節并在固有免疫中發揮作用[17,18]，其與系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、干燥綜合征、銀屑病、肌萎縮性脊髓側索硬化癥等多種自身免疫性疾病的發生、發展相關。在纖維化方面的研究中也發現，通過注射外源性miR-146a后可通過抑制促纖維化因子釋放和炎癥通路激活抑制腎纖維化的發生、發展[19]。有研究還發現，miR-146a還可通過作用于肝星狀細胞的TGF/Smad和LPS/NF-κB/Bambi信號通路阻斷肝纖維化進程[20]。

本研究結果顯示，模型組miR-146a相對表達量明顯低于假手術組，提示miR-146a下調可促進肺纖維化的發生。為驗證miR-146a下調在肺纖維化發生中的作用，我們制作了過表達miR-146a的成纖維細胞模型并觀察了其細胞增殖及NF-κB信號通路相關因子表達情況，結果顯示，miR-146a過表達組細胞增殖率明顯低于對照組及空白組，TGF-β1及IκBα蛋白表達明顯低于對照組及空白組，NF-κB p65蛋白表達明顯高于對照組及空白組。進一步證實miR-146a對肺成纖維細胞增殖有抑制作用。其抑制成纖維細胞增殖的機制可能為：miR-146a 3′端啟動子區域存在多個核轉錄因子NF-κB的結合位點[21]，TNF-α、IL-1等炎癥相關因子作用于細胞后激活IκBα，發生磷酸化并脫離NF-κB后，使NF-κB的核定位信號區暴露，促進NF-κB磷酸化，使其向細胞核內轉移，參與TGF-β1合成，同時誘導了miR-146a表達，上調的miR-146a則可負反饋調節抑制NF-κB信號通路，負性調控NF-κB活化，抑制其下游因子TGF-β1釋放，從而調控細胞增殖程度。過表達miR-146a可導致NF-κB信號通路受抑制，核內轉移減少，TGF-β1合成減少，從而抑制細胞增殖。

綜上所述，肺纖維化小鼠肺組織miR-146a表達下調，其可通過阻止細胞內NF-κB核轉位而抑制成纖維細胞增殖和分化，從而延緩肺纖維化的發生及進展。