彌漫性大B細胞淋巴瘤組織Livin和Caspase-3表達變化及意義

劉兆玉，葛金麗，周震滄，王玉蘭，李強，李行

(遵義市第一人民醫院，貴州遵義563002)

彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)是成人非霍奇金淋巴瘤的最常見類型，多見于中老年人，以40～50歲居多。DLBCL是一類具有高度異質性的疾病，其在臨床表現、組織形態學、免疫表型及遺傳學特征等方面都具有明顯異質性。目前DLBCL的發病原因和機制尚不完全清楚，臨床上缺乏特異性診斷標志物，易誤診[1～3]。凋亡抑制蛋白(IAP)是一類重要的細胞凋亡抑制因子，與多種腫瘤的發生、發展密切相關[4，5]。Livin是IAP家族中的新成員，是從人類基因組cDNA庫中由IAP同源序列克隆獲得，可抑制天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)死亡效應結構域活性[6]。Caspase家族引發的級聯反應是細胞凋亡過程的中心環節。Caspase-3屬于Caspase家族成員之一，可通過調控細胞凋亡方式參與機體生理、病理過程，并與多種腫瘤的發生、發展密切相關。本研究觀察了DLBCL患者病變淋巴組織Livin和Caspase-3表達變化，并探討其在DLBCL發生、發展中的作用。現報告如下。

1 臨床資料

選擇2012年1月～2017年3月遵義市第一人民醫院收治的DLBCL患者69例(DLBCL組)。所有患者經組織病理檢查明確診斷，入院前未行任何抗腫瘤治療，排除合并其他影響本研究檢測結果的疾病者以及臨床病理資料或隨訪資料不完整者。其中，男38例、女31例，年齡25～78(59.32±13.57)歲；首發部位：淋巴結內35例，淋巴結外34例；病理類型：生發中心B細胞(GCB)型17例，非GCB型52例；Ann Arbor分期：Ⅰ期9例，Ⅱ期11例，Ⅲ期41例，Ⅳ期8例。選擇同期遵義市第一人民醫院收治的反應性增生性淋巴結炎(RHL)患者30例(RHL組)，男17例、女13例，年齡31～74(60.13±9.22)歲。兩組性別、年齡具有可比性。本研究經遵義市第一人民醫院醫學倫理委員會批準，患者或其家屬均知情同意。

2 方法與結果

2.2 病變淋巴組織Livin、Caspase-3表達檢測 采用免疫組化Elivision法。取兩組病變淋巴組織標本，石蠟包埋，4 μm厚連續切片。切片常規脫蠟、水化，置于檸檬酸緩沖液中95 ℃熱抗原修復10 min，自然冷卻至室溫。PBS沖洗3 min×3次，滴加兔抗人Livin多克隆抗體、兔抗人Caspase-3多克隆抗體，4 ℃孵育過夜。次日，PBS沖洗3 min×3次，滴加Elivision試劑盒試劑A(聚合物增強劑)，室溫孵育20 min。滴加Elivision試劑盒試劑B(酶標抗兔IgG聚合物)，室溫孵育30 min。最后DAB顯色，蘇木素復染，常規梯度乙醇脫水，中性樹膠封片。采用雙盲法由兩位病理科高年資醫師獨立閱片，結果不一致時，由上級醫師判定。結果判定采用半定量評分法。隨機選取4個400倍視野，觀察每視野染色強度并計數陽性細胞比例。Livin、Caspase-3陽性染色均定位于細胞核、細胞質，呈棕黃色顆粒。染色強度計分：不著色為0分，淺黃色為1分，黃棕色為2分，褐色為3分；陽性細胞所占比例計分：≤5%為0分，>5%～25%為1分，>25%～75%為2分，>75%為3分。以染色強度計分和陽性細胞所占比例計分綜合判定Livin、Caspase-3陽性表達，二者計分乘積>3分為陽性表達。結果顯示，DLBCL組與RHL組病變淋巴組織Livin陽性表達率分別為57.97%(40/69)、0，Caspase-3陽性表達率分別為24.64%(17/69)、86.67%(26/30)。DLBCL組病變淋巴組織Livin、Caspase-3陽性表達率均高于RHL組(χ2分別為29.182、32.745，P均<0.01)。

2.3 DLBCL病變淋巴組織Livin、Caspase-3陽性表達與患者臨床病理參數的關系 GCB型DLBCL患者病變淋巴組織Livin陽性表達率低于非GCB型者，Caspase-3陽性表達率高于非GCB型者(P均<0.01)；Ann Arbor分期Ⅰ、Ⅱ期者病變淋巴組織Livin陽性表達率低于Ⅲ、Ⅳ期者， Caspase-3陽性表達率高于Ⅲ、Ⅳ期者(P均<0.05)；Livin、Caspase-3陽性表達與患者年齡、性別、首發部位均無關(P均>0.05)。見表1。

2.4 DLBCL病變淋巴組織Livin陽性表達與Caspase-3陽性表達的關系 DLBCL病變淋巴組織Livin陽性表達與Caspase-3陽性表達呈負相關關系(r=-0.308，P<0.01)。

表1 DLBCL病變淋巴組織Livin、Caspase-3陽性表達與患者臨床病理參數的關系[例(%)]

2.5 DLBCL病變淋巴組織Livin、Caspase-3表達與患者預后的關系 患者出院后通過電話、門診等方式隨訪，隨訪截至2017年12月，隨訪時間9～62(36.13±14.14)個月，中位隨訪時間33個月。DLBCL病變淋巴組織Livin陰性表達者與陽性表達者生存率分別為86.21%(25/29)、42.50%(17/40)，生存時間分別為(52.14±2.65)、(42.50±2.74)個月；DLBCL病變淋巴組織Livin陰性表達者生存率和生存時間均高于Livin陽性表達者(P均<0.01)。DLBCL病變淋巴組織Caspase-3陰性表達者與陽性表達者生存率分別為51.92%(27/52)、88.24%(15/17)，生存時間分別為(44.71±2.48)、(50.18±3.09)個月；DLBCL病變淋巴組織Caspase-3陽性表達者生存率和生存時間均高于Caspase-3陰性表達者(P均<0.01)。

3 討論

Livin定位于染色體20q13.3，具有兩種異構體，分別為Livin-α、Livin-β，其cDNA長度分別為897、843 bp，二者分布雖有一定差異，但總體上變化不大[6，7]。正常成人機體中Livin只表達于胚胎及胎盤組織，未見于其他組織。近年研究發現，多種腫瘤組織中可見Livin陽性表達。如在中晚期直腸癌組織中Livin異常高表達，且其陽性表達者預后較差[8]；在乳腺癌組織中Livin異常高表達，且通過p38/GSK3β信號通路促進乳腺癌的進展與轉移，Livin高表達者預后較Livin低表達者差[9]。在關于人肺腺癌組織及A549細胞的聯合研究中發現，肺腺癌組織Livin異常高表達，經相關微小RNA沉默Livin表達的肺腺癌A549細胞增殖減少、凋亡增加[10]。說明Livin可能與腫瘤的發生、發展有關。本研究結果顯示，在DLBCL病變淋巴組織中Livin陽性表達率明顯升高，且其陽性表達與Ann Arbor分期密切相關，進一步證實Livin參與了DLBCL的發生、發展過程。GCB型DLBCL患者病變淋巴組織Livin陽性表達率顯著低于非GCB型者，提示Livin與DLBCL的起源有關。

目前認為，Livin抑制細胞凋亡主要通過兩個途徑，即激活TAK1/JNK1信號通路[11]、抑制Caspase途徑[12]。Caspase家族引發的級聯反應是細胞凋亡過程的中心環節。Caspase-3屬于Caspase家族成員之一，是細胞凋亡過程中的下游效應蛋白，其編碼基因定位于染色體4q32-35.1，主要表達于人體細胞胞質部位，但細胞核中亦可表達[13]。機體細胞內的Caspase-3以酶原形式存在，當細胞進入內源性或外源性凋亡途徑，Caspase-3即會被激活，因而可將Caspase-3視為細胞凋亡的標志因子[14]。Caspase-3通過調控細胞凋亡不僅參與機體生理、病理過程，還與多種惡性腫瘤的發生、發展密切相關。Li等[15]研究發現，口腔鱗癌組織Caspase-3表達明顯低于正常組織，且隨著腫瘤的惡性進展，Caspase-3表達進一步降低。Yusuf等[16]報道，在結直腸癌組織中Caspase-3表達明顯降低，且其低表達者預后較差。本研究結果顯示，DLBCL病變淋巴組織Caspase-3陽性表達率明顯降低，且其表達與患者Ann Arbor分期有關。說明DLBCL的發生、發展可能與Caspase-3表達受抑制有關。

Gu等[17]研究發現，前列腺癌組織Livin表達與Caspase-3表達呈負相關關系。Li等[18]研究發現，應用替莫唑胺的人神經膠質瘤U251細胞Livin表達下降，同時Caspase-3表達上升，二者表達同樣呈負相關關系。本研究結果顯示，DLBCL病變淋巴組織Livin陽性表達與Caspase-3陽性表達亦呈負相關關系，提示Livin、Caspase-3在DLBCL中的效應可能與前述組織中類似，即二者具有拮抗作用。本研究隨訪結果顯示，DLBCL病變淋巴組織Livin陽性表達者生存率低于Livin陰性表達者，生存時間短于Livin陰性表達者；DLBCL病變淋巴組織Caspase-3陰性表達者生存率低于Caspase-3陽性表達者、生存時間短于Caspase-3陽性表達者。提示Livin陽性表達及Caspase-3陰性表達的DLBCL患者預后不良。

綜上，DLBCL病變淋巴組織Livin表達上調、Caspase-3表達下調，二者表達變化可能參與DLBCL的發生、發展，并與患者不良預后密切相關。