Klotho基因G-395A位點多態性與糖尿病腎病的關系

李楊，黃鄧高，鄭琳麟，曹卉，高元慧，范忠誠

(中南大學湘雅醫學院附屬海口醫院，海口570208)

糖尿病腎病是糖尿病最嚴重的慢性并發癥之一，目前在我國其患病率已超過慢性腎小球腎炎，已成為慢性腎臟病的首位病因[1]。糖尿病腎病的確切發病機制尚不完全清楚。有研究認為，糖尿病腎病是一種多基因遺傳異質性疾病，遺傳因素可通過影響腎臟對環境因素的反應性來增加糖尿病腎病的易感性。Klotho基因是一種與衰老有關的基因，主要在腎臟中表達[2～4]，具有抗腎臟纖維化、調節鈣磷代謝、抑制氧化應激等多種生物學功能[5]。研究發現，Klotho基因與糖尿病和糖尿病腎病有關，該基因突變會導致其轉錄功能改變，可能會導致代謝紊亂加重[6]。Klotho基因含有多個單核苷酸多態性位點，其G-395A位點(rs1207568)位于啟動子區域，而啟動子作為順式作用元件的一部分，可參與調控基因表達。因此，G-395A位點突變雖不能改變Klotho蛋白的氨基酸序列，但可能是影響Klotho基因表達調控的環節之一。本研究探討Klotho基因G-395A位點多態性與糖尿病腎病的關系。現分析結果并報告如下。

1 臨床資料

選取2016年1月～2017年10月中南大學湘雅醫學院附屬海口醫院收治的單純2型糖尿病患者147例(單純糖尿病組)，男76例、女71例，年齡(50.7±5.5)歲，BMI (25.1±1.2)kg/m2；糖尿病腎病患者98例(糖尿病腎病組)，男57例、女41例，年齡(52.0±9.1)歲，BMI (26.6±3.8)kg/m2。糖尿病診斷符合1999年WHO制定的標準，糖尿病腎病診斷符合《中國2型糖尿病防治指南》(2010版)制定的診斷標準。排除合并惡性腫瘤、急慢性感染性疾病者。選擇同期在中南大學湘雅醫學院附屬海口醫院體檢的健康志愿者100例(健康組)，男57例、女43例，年齡(52.1±6.2)歲，BMI (24.4±3.1)kg/m2。研究對象均為長期生活在海南地區的漢族人，相互之間無血緣關系。三組性別、年齡、BMI具有可比性。本研究經中南大學湘雅醫學院附屬海口醫院醫學倫理委員會批準，患者或其家屬均知情同意。三組血壓、血糖、血脂等相關指標比較見表1。

表1 三組血壓和血生化相關指標比較

組別 n TG(mmol/L) LDL-C(mmol/L) HDL-C (mmol/L) BUN (mmol/L) Scr(μmol/L)健康組 100 1.74±1.42 3.27±1.17 1.51±0.32 5.40±1.28 61.01±13.07單純糖尿病組147 1.92±1.30 3.24±1.13 1.55±0.28 5.87±1.35 70.08±20.76糖尿病腎病組98 2.40±1.14?3.65±1.41 1.44±0.40 8.01±1.92?#118.90±26.10?#

注：與健康組比較，*P<0.05；與單純糖尿病組比較，#P<0.05。

2 方法與結果

2.2 Klotho基因G-395A位點多態性檢測 三組均采集空腹靜脈血4 mL，置于EDTA抗凝管中，室溫靜置30 min，分離血細胞，按柱式小量血液DNA抽提試劑盒說明抽提基因組DNA。采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應技術中TaqMan熒光探針法檢測G-395A(rs1207568)位點多態性。將選定的G-395A(rs1207568)多態性位點在Applied Biosystems公司網站上查找相應的TaqMan-MGB探針，將探針標號及多態性位點一起送至Applied Biosystems公司合成引物和探針。按PCR反應試劑盒說明配制反應體系，于ABI Prism7300型熒光定量PCR擴增儀按相應的反應條件進行擴增。PCR反應體系共15 μL：20×引物及熒光探針混合溶液0.5 μL，2×TaqMan通用PCR擴增預混試劑7.5 μL，ROX Reference Dye溶液0.3 μL，A模板1.5 μL，滅菌蒸餾水5.2 μL；反應條件：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s、65 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s共35個循環，最后72 ℃延伸10 min。擴增產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，并將測序結果與Klotho基因序列進行Blast比對。采用基因計數法計算各組基因型及等位基因分布。經Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，三組Klotho基因G-395A位點基因型分布均符合遺傳平衡定律，說明研究對象均具有樣本代表性。由于GG基因型相對較少，與GA合并分析。結果顯示，健康組GA基因型+GG基因型49例、AA基因型51例，單純糖尿病組分別為70、77例，糖尿病腎病組分別為30、68例，健康組與單純糖尿病組AA基因型分布明顯低于糖尿病腎病組，GA基因型+GG基因型分布明顯高于糖尿病腎病組(P均<0.05)，健康組與單純糖尿病組AA基因型、GA基因型+GG基因型分布比較P均>0.05；健康組A、G等位基因頻數分別為132、68，單純糖尿病組分別為199、95，糖尿病腎病組分別為157、39，健康組與單純糖尿病組A等位基因頻數明顯低于糖尿病腎病組，G等位基因頻數明顯高于糖尿病腎病組(P均<0.05)，健康組與單純糖尿病組A、G等位基因頻數比較P均>0.05。見表2。

表2 各組Klotho基因G-395A位點基因型和等位基因分布情況

2.3 糖尿病腎病發病的危險因素分析 以糖尿病腎病為應變量，以表1中有統計學差異的指標(SBP、FPG、HbA1c、TC、TG、BUN、Scr)及G-395A位點基因型(AA、GA+GG)為自變量，進行多因素非條件Logistic回歸分析，結果顯示，SBP、HbA1c、G-395A位點AA基因型分布增加是糖尿病腎病發病的危險因素。見表3。

表3 糖尿病腎病發病的多因素Logistic回歸分析結果

3 討論

Maeda等[7]通過全基因組關聯研究發現，染色體13q區異常與糖尿病腎病的易感性有關。Klotho基因定位于13q12區域，由5個外顯子和4個內含子組成，G-395A位點位于其啟動子區域，本身并不編碼任何蛋白質，而是參與調控基因表達[8]。Klotho基因是一種與衰老有關的基因，具有抗腎臟纖維化、調節鈣磷代謝、抑制氧化應激等多種生物學功能。Klotho蛋白主要表達于腎臟、腦組織脈絡膜、甲狀旁腺等組織，尤其是腎皮質小管上皮細胞[9]。研究發現，Klotho基因表達變化與糖尿病腎病的發生、發展有關，其高表達具有腎臟保護作用[10，11]；早期糖尿病腎病患者腎組織Klotho基因表達降低[12]。體外和體內研究證實，過表達Klotho基因或及時補充外源性Klotho蛋白可保護腎臟結構和功能，延緩糖尿病腎病進展。目前認為，Klotho基因可通過抑制細胞凋亡、抵抗機體內氧化應激和炎癥反應，抑制高糖對腎臟的損傷[13]；Klotho基因可調控RAAS系統，調節內皮細胞功能，通過調控多種細胞因子表達，抑制腎臟纖維化；Klotho基因還可調節鈣磷代謝，阻止血管平滑肌細胞鈣化，調控離子轉運，繼而保護腎臟[14]。Klotho蛋白缺乏時可通過增強TGF-β1、mTOR信號通路，促進早期糖尿病腎病的發生[15]；而過表達Klotho基因可通過下調早期生長反應因子1而抑制TGF-β1/Smad3信號通路，從而抑制腎小球系膜細胞外基質形成，減輕腎臟纖維化[16]。

Klotho基因G-395A位點是重要的遺傳篩選標記和潛在的功能性多態性位點，該位點多態性可影響啟動子的轉錄過程。故本研究觀察了海南地區漢族人群Klotho基因G-395A位點多態性與糖尿病腎病的關系。有研究顯示，糖尿病患者或小鼠胰島組織Klotho基因表達降低[17～19]。Lin等[17]研究發現，db/db小鼠胰腺β細胞Klotho基因過表達可改善高血糖所致的β細胞損傷，降低高血糖并增加糖耐量；增加循環中Klotho蛋白對糖尿病患者也有類似效果。Forsberg等[18]研究顯示，db/db小鼠肝組織Klotho基因過表達可導致血糖水平下降，胰島β細胞功能得以改善。上述結果提示，無論過表達Klotho基因還是補充外源性Klotho蛋白對糖尿病均有益。Kawano等[20]應用電泳遷移率變動分析顯示，由G等位基因形成的DNA蛋白復合物的量明顯高于由A等位基因形成的DNA蛋白復合物的量，提示G突變為A可能通過減少蛋白和啟動子的結合而影響Klotho基因的功能。本研究結果顯示，Klotho基因G-395A位點出現了AA、GA、GG三種基因型，健康組與單純糖尿病組AA基因型分布明顯低于糖尿病腎病組，GA基因型+GG基因型分布明顯高于糖尿病腎病組，而健康組與單純糖尿病組AA基因型、GA基因型+GG基因型分布比較差異均無統計學意義；健康組與單純糖尿病組A等位基因頻數明顯低于糖尿病腎病組，G等位基因頻數明顯高于糖尿病腎病組，而健康組與單純糖尿病組A、G等位基因頻數比較差異均無統計學意義。多因素Logistic回歸分析顯示，Klotho基因G-395A位點AA基因型分布增加是發展為糖尿病腎病的危險因素。提示A等位基因可能通過抑制Klotho基因表達，繼而導致胰島β細胞損傷，最終出現糖尿病腎病。但此結論還需大規模、多中心的臨床研究驗證。

綜上所述，Klotho基因G-395A位點多態性與糖尿病腎病發病有關，該位點AA基因型分布增加可能是糖尿病腎病發病的獨立危險因素。