肝細胞癌組織核因子E2相關因子3表達變化及意義

王振偉，陶佳，郝帥，晏亭，楊玉菡，劉虹邑，任勇剛

(1 川北醫學院，四川南充637000；2 川北醫學院附屬醫院)

肝細胞癌是起源于肝細胞的惡性腫瘤，其發生、發展是一個漫長的過程，涉及轉錄調控、遺傳學及腫瘤免疫學等[1,2]。與肝細胞癌發生最相關的遺傳學因素包括宿主細胞p53、Ras、Rb等基因突變，但與肝細胞癌發生相關的特異性基因尚未明確[3,4]。核因子E2相關因子3(NFE2L3)屬于CNC堿性亮氨酸拉鏈蛋白家族，又稱Nrf3，定位于染色體7p15.2，編碼694個氨基酸，其生物學功能尚未闡明[5～7]。目前鮮見關于NFE2L3與肝細胞癌有關的報道。本研究探討肝細胞癌組織NFE2L3表達變化及意義?，F分析結果并報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年10月～2017年9月川北醫學院附屬醫院收治的肝細胞癌患者44例，男34例、女10例，年齡43～70(55.24±8.03)歲；組織分化程度：低分化23例，中分化12例，高分化9例；合并肝硬化27例，乙肝36例；TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期31例，Ⅲ、Ⅳ期13例；Child-Pugh肝功能分級：A級25例，B、C級19例。肝細胞癌診斷符合《原發性肝癌診療規范(2011年版)》中肝癌診斷標準，TNM分期符合美國癌癥聯合會和國際抗癌聯盟標準。納入標準：經組織病理學檢查及血清標志物檢測明確診斷為肝細胞癌；除肝細胞癌外無其他惡性腫瘤；手術切除腫瘤，術中留取癌旁正常組織；術前未進行放療、化療及免疫治療；臨床病理資料完整。本研究經川北醫學院附屬醫院醫學倫理委員會批準，患者或其家屬均知情同意。

1.2 肝組織NFE2L3表達檢測 采用免疫組化兩步法。取肝癌組織及癌旁正常組織，石蠟包塊，3～5 μm厚連續切片。石蠟切片常規脫蠟、水化，加入3%過氧化氫50 μL，室溫孵育10 min；浸于檸檬酸鹽緩沖液修復組織抗原30 min；滴加5% BSA封閉液，室溫孵育10 min，棄去多余液體；滴加NFE2L3一抗(工作液濃度1∶25，美國ABGENT公司)，37 ℃孵育3～4 h；滴加聚合HRP標記抗兔IgG，37 ℃孵育30 min；DAB顯色，蒸餾水沖洗，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以PBS代替NFE2L3一抗作為陰性對照，陽性對照為已知NFE2L3蛋白陽性表達的組織切片。NFE2L3陽性表達主要定位于細胞質，在細胞核也有表達，呈散在分布的淡黃色或棕黃色顆粒。根據染色強度及陽性細胞所占比例綜合評分判定結果[8]。陽性細胞染色強度為不著色、淡黃色、黃色、棕黃色分別記0、1、2、3分；陽性細胞所占比例<10%記0分，10%～<25%記1分， 25%～<50%記2分， 50%～<75%記3分，≥75%記4分。兩項評分之和>4分為NFE2L3陽性表達。分析肝癌組織NFE2L3陽性表達與患者臨床病理參數的關系。

1.3 癌癥基因組圖譜(TCGA)數據分析 下載TCGA數據庫(https://tcga-data.nci.nih.gov/)中關于肝細胞癌的RNASeq Version2數據(Level 3，normalizeddata)。肝細胞癌數據集共包括371例份肝細胞癌組織和51例份癌旁正常組織。測序平臺為Illumina hiseq2000，數據下載時間為2017年8月。利用R(Version3.4.0)軟件包limma提供的經驗貝葉斯方法對基因表達值進行線性建模[9]，然后進行肝癌組織與癌旁正常組織NFE2L3表達的差異分析。檢驗后得到NFE2L3平均表達值(AveExpr)、肝癌組織與癌旁正常組織差異表達倍數(log2FC)，相應統計學差異分析的P，使用Benjamini & Hochberg方法進行多重檢驗校正，得到校正后P(adj.P)。差異表達閾值均為adj.P<0.05且|log2FC|>1(即2倍變化)。

1.4 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件。計數資料比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝癌組織和癌旁正常組織NFE2L3表達比較 肝癌組織NFE2L3陽性表達率為70.45%(31/44)，癌旁正常組織為15.91%(7/44)，二者比較P<0.05。

2.2 肝癌組織NFE2L3陽性表達與患者臨床病理參數的關系 肝癌組織NFE2L3陽性表達與腫瘤組織分化程度、患者是否合并乙肝有關(P均<0.01)，與患者性別、年齡、是否合并肝硬化、TNM分期、肝功能分級無關(P均>0.05)。見表1。

表1 肝癌組織NFE2L3陽性表達與患者臨床病理參數的關系

2.3 TCGA數據庫肝細胞癌數據集中肝癌組織和癌旁正常組織NFE2L3表達比較 肝癌組織NFE2L3表達顯著高于癌旁正常組織，log2FC=0.750 121 651，AveExpr=2.336 727 847，P<0.01，adj.P<0.01。

3 討論

肝細胞癌多呈低分化，侵襲和轉移能力強，復發率和病死率均較高[10]。核因子E2(NFE2)家族為高度保守的調節性轉錄因子家族，主要參與維持細胞穩態和組織發育[11]。NFE2家族主要包括NFE2L1、NFE2L2、NFE2L3、NF-E2 p45及其轉錄抑制因子Bach1、Bach2[12]。目前，關于抗氧化基因轉錄調控的研究多集中于NFE2L2及NFE2L1。當出現病毒感染、外源性藥物、炎癥等刺激時，機體內氧化還原穩態被打破，誘導激活NFE2成員，調節NAD(P)H醌脫氫酶1基因表達[13,14]。通常情況下，NFE2蛋白與Maf蛋白結合組成二聚體，通過抗氧化應激元件結合于靶基因啟動子，調節下游基因表達。NFE2家族成員在調節胚胎發育中扮演重要角色，尤其是NFE2L1[15]。Xu等[16]研究發現，成年小鼠肝細胞NFE2L1基因被敲除后易形成脂肪肝并有可能惡變為肝癌。進一步研究證實，相對于高分化肝癌組織，低分化肝癌組織NFE2L1表達顯著降低，并扮演抑癌基因角色；NFE2L1可能通過促進細胞上皮間質轉化，參與肝癌的發生和進展[17]。此外，NFE2家族在非酒精性脂肪肝病的發生及進展中也發揮重要作用，其作用機制主要包括影響胰島素耐受、調節氧化應激和刺激脂質過氧化反應等[18～21]。

NFE2L3廣泛表達于人體組織器官，其作為一種高度保守的調節性轉錄因子，通過結合抗氧化反應元件和親電子體反應元件，調控下游基因表達，維持細胞穩態。與同源的NFE2L1、NFE2L2相比，目前對NFE2L3功能的研究相對較少。Sankaranarayanan等[22]報道，NFE2L3通過抑制細胞黏附，促進紫外線誘導的角質形成細胞凋亡。Chowdhury等[23]研究則證實，NFE2L3通過作用于蛋白酶體等調節腫瘤細胞增殖。最近的研究結果顯示，NFE2L3的結構修飾和區域改變對調控細胞分化、炎癥反應和細胞癌變具有重要意義[24]，但其具體的分子機制仍不清楚。

本研究結果顯示，肝癌組織NFE2L3陽性表達率顯著高于癌旁正常組織，提示NFE2L3可能作為促癌基因直接或間接作用促進肝癌的發生。但有研究報道，NFE2L3對人大腸癌LoVo細胞增殖具有一定抑制作用，其可能作為抑癌基因參與大腸癌的發生[25,26]，與本研究結果矛盾，其原因可能為NFE2L3在肝細胞癌和結直腸癌組織中的基礎表達有一定差異，故其生物學功能不同。本研究肝癌組織NFE2L3陽性表達與腫瘤組織分化程度有關，低分化肝癌組織NFE2L3陽性表達顯著高于中高分化組織，提示NFE2L3可能是一個與肝癌侵襲和轉移相關的潛在生物標記分子。本研究肝癌組織NFE2L3陽性表達與腫瘤TNM分期、肝功能分級無關，可能與樣本量偏少有關。NFE2L3陽性表達與肝癌患者是否合并乙肝顯著相關，但與是否合并肝硬化無明顯相關。乙型肝炎病毒(HBV)感染是肝細胞癌發生的病因之一。HBV能夠在宿主細胞內持續存在，并協同遺傳學及表觀遺傳學改變，共同調控參與肝細胞癌發生的信號通路[27]。HBV的HBX基因被認為不能直接與DNA結合，而是通過與轉錄因子、信號分子等因子相互作用直接或間接發揮調控功能[28]。已有研究證實，HBX基因能夠反式激活宿主細胞基因，促進血管內皮生長因子、Myc原癌基因等生長因子及原癌基因表達[29]。在應激刺激下，HBV可通過調節NFE2L3表達，介導下游促炎、抗炎信號通路，調控細胞增殖、凋亡等相關基因表達，促進乙肝向肝癌惡性轉化。本研究發現，NFE2L3陽性表達與患者是否合并肝硬化并無顯著相關，這可能是由于肝硬化病因廣泛，既可能是HBV感染引起的，也可能是長時間飲酒或代謝性異常引起的。肝硬化與肝細胞癌的確切關系還有賴于后期擴大樣本、完善分組并結合細胞、動物模型進一步明確。

為進一步驗證臨床病例研究結果，明確NFE2L3在肝癌組織和癌旁正常組織中的差異表達，本研究利用生物信息學方法分析了TCGA數據庫收集的肝細胞癌數據集。統計分析結果顯示，NFE2L3基因在肝癌組織中的表達顯著高于癌旁正常組織，但其差異表達倍數log2FC較小，AveExpr為2.336 727 847，P<0.01。以上分析結果與本研究檢測結果一致，進一步在大范圍樣本中確認轉錄因子NFE2L3在肝癌組織中高表達，并與肝細胞癌的發生、發展密切相關，可能是肝細胞癌發生的一種促癌因子。

綜上所述，NFE2L3可能作為促癌因子參與肝細胞癌的發生、發展。