游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK表達(dá)的影響

謝冰，肖樂，劉超，李元，孔瑛

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種常見的慢性進(jìn)行性肌肉骨骼疾病，以關(guān)節(jié)軟骨退變，軟骨下骨硬化，關(guān)節(jié)邊緣骨贅形成為主要特征，使人們的生活質(zhì)量下降，給家庭、社會(huì)帶來了嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展過程中，軟骨細(xì)胞的凋亡起了重要的作用[1-2]。骨關(guān)節(jié)炎病變過程中，軟骨細(xì)胞凋亡顯著增多，軟骨細(xì)胞大量減少，同時(shí)伴有細(xì)胞外基質(zhì)降解，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的退變[3]。引起軟骨細(xì)胞凋亡的原因有很多種，而通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡是目前研究的熱點(diǎn)[4]。已有大量的研究證明骨關(guān)節(jié)炎患者及大鼠均可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的軟骨細(xì)胞的凋亡[5-6]。而蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)被認(rèn)為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生的標(biāo)志[7]。通過研究骨關(guān)節(jié)炎內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK的表達(dá)情況，可進(jìn)一步明確PERK在關(guān)節(jié)軟骨退變中的作用，并為骨關(guān)節(jié)炎的防治提供新的方向及新靶點(diǎn)。

目前治療骨關(guān)節(jié)炎的方法有很多種，而游泳運(yùn)動(dòng)被認(rèn)為對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的治療起重要作用[8]。然而目前對(duì)于游泳對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的具體作用機(jī)制還不明確。本研究通過制造大鼠膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型，同時(shí)進(jìn)行游泳訓(xùn)練，探討游泳對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK表達(dá)的影響，明確游泳能否通過影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK的表達(dá)，減少軟骨細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨，防止關(guān)節(jié)軟骨退化，進(jìn)而明確游泳的治療效果，為指導(dǎo)進(jìn)行正確的康復(fù)訓(xùn)練提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 ①實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由湖南省人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供的雄性健康Sprague-Dawley(SD)大鼠24只，6～8周齡，體質(zhì)量220～260g。各鼠分籠飼養(yǎng)，進(jìn)食及飲水符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)。適應(yīng)性飼養(yǎng)3d后，采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為空白對(duì)照組(A組)、假手術(shù)組(B組)，模型對(duì)照組(C組)和游泳運(yùn)動(dòng)組(D組)，每組6只。大鼠籠內(nèi)自由活動(dòng)，所有動(dòng)物均選取右膝關(guān)節(jié)為實(shí)驗(yàn)側(cè)。②主要實(shí)驗(yàn)儀器與試劑： 游泳池(由湖南省人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，長(zhǎng)70cm，寬70cm，高100cm)、PERK抗體[兔抗大鼠，濃度(1∶50)，貨號(hào)：Sc-13073,Santa Cruz生物公司]、二抗試劑盒：rabbit ABC staining system[濃度約為1ug/ml，(貨號(hào)：Sc-2018,Santa Cruz生物公司)]。

1.2 方法 ①骨關(guān)節(jié)炎模型的建立：稱重后，10%水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉大鼠，備皮消毒后沿髕韌帶內(nèi)側(cè)緣切開皮膚，顯露膝關(guān)節(jié)后將髕骨外翻，打開關(guān)節(jié)囊，分離前交叉韌帶并剪斷，行抽屜實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證是否成功。分離內(nèi)側(cè)半月板并切除內(nèi)側(cè)前部半月板。生理鹽水沖洗關(guān)節(jié)腔后逐層縫合，絡(luò)合碘擦洗傷口，手術(shù)當(dāng)天及術(shù)后第1、2天肌肉注射8萬U青霉素預(yù)防感染。假手術(shù)組只打開關(guān)節(jié)腔暴露前交叉韌帶及半月板后即縫合。待 SD大鼠清醒后按編號(hào)分籠，讓其自由活動(dòng)及進(jìn)食，同時(shí)觀察大鼠一般情況并記錄。②分組處理：A組，籠內(nèi)自由活動(dòng)8周，不予特殊處理；B組，假手術(shù)后籠內(nèi)自由活動(dòng)8周，不予治療；C組，造模后籠內(nèi)自由活動(dòng)8周，不予治療；D組，造模籠內(nèi)自由活動(dòng)4周后進(jìn)行游泳訓(xùn)練，每日1次，每次30min，連續(xù)4周。

1.3 標(biāo)本采集與處理 ①標(biāo)本的采集與處理：治療結(jié)束后斷頸法處死大鼠，切開實(shí)驗(yàn)側(cè)膝關(guān)節(jié)，顯露關(guān)節(jié)軟骨，觀察關(guān)節(jié)內(nèi)軟組織、滑膜、關(guān)節(jié)液、關(guān)節(jié)軟骨等情況，并進(jìn)行大體評(píng)分。觀察完畢后，取內(nèi)側(cè)脛骨端軟骨下2cm固定、脫鈣、包埋切片后作甲苯胺藍(lán)、HE染色及免疫組織化學(xué)染色以進(jìn)行組織學(xué)觀察。②軟骨病理學(xué)觀察：打開關(guān)節(jié)腔后肉眼觀察脛骨關(guān)節(jié)軟骨面的大體形態(tài)，并按照大體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分[9]，評(píng)分越高表明關(guān)節(jié)軟骨損傷越重。③組織學(xué)觀察：觀察HE染色及甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果，評(píng)價(jià)軟骨形態(tài)、細(xì)胞數(shù)量、基質(zhì)染色、及潮線完整性等情況，采用雙盲法對(duì)標(biāo)本按關(guān)節(jié)軟骨光鏡改良Mankin評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[10]進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分越高，表明關(guān)節(jié)軟骨損傷越重。④免疫組織化學(xué)觀察：進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，石蠟切片60℃恒溫烤箱烘烤2h，常規(guī)脫蠟至水，3%的過氧化氫滅活內(nèi)源性的過氧化物酶；滴加胃蛋白酶，37℃孵育；滴加透明質(zhì)酸酶，37℃孵育；山羊血清封閉，室溫孵育，滴加PERK一抗(1∶50)50μl，4℃冰箱過夜，復(fù)溫后滴加生物素化二抗工作液50μl，37℃溫箱孵育；辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈卵白素工作液37℃孵育；二氨基聯(lián)苯胺染色，鏡下控制顯色時(shí)間；蘇木素復(fù)染，脫水，透明，中性樹脂封片。觀察免疫組織化學(xué)染色結(jié)果，用中倍(×200)鏡觀察軟骨細(xì)胞PERK的胞漿著色情況。PERK陽性細(xì)胞表現(xiàn)為軟骨細(xì)胞胞漿呈棕黃色染色。計(jì)算陽性率：采用IPP(Image-Pro Plus6.0)圖像分析軟件進(jìn)行分析，測(cè)其平均光密度值。每張切片中倍(×200)鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野，分別對(duì)各組之間的平均光密度值進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察及評(píng)分 ①大體觀察。A組：軟骨表面色澤明亮，為半透明狀，光滑，無裂隙、潰瘍及破損，輪廓清晰，關(guān)節(jié)滑膜平整光滑，關(guān)節(jié)液清亮，關(guān)節(jié)內(nèi)無粘連(圖1-a)。B組：軟骨表面色澤較正常組稍暗，為半透明狀，光滑，無裂隙，關(guān)節(jié)滑膜少有粘連，關(guān)節(jié)液稍黃，關(guān)節(jié)內(nèi)有粘連(圖1-b)。C組：軟骨表面呈灰白色，不透明，軟骨面粗糙，凹凸不平，軟骨面可見明顯的裂隙、糜爛、潰瘍，軟骨下骨暴露，部分關(guān)節(jié)邊緣可見骨贅形成。關(guān)節(jié)囊增厚，滑膜不同程度增生、粘連，部分可見滑膜囊腫。關(guān)節(jié)液渾濁，色澤較黃，關(guān)節(jié)腔內(nèi)粘連(圖1-c)。D組：軟骨表面色澤稍暗，透明度下降，軟骨表面稍有不平，可見裂隙、潰瘍及破損，無骨贅及軟骨下骨暴露。滑膜稍有增生，未見囊腫。關(guān)節(jié)液稍黃，關(guān)節(jié)腔內(nèi)有粘連(圖1-d)。②大體評(píng)分：B組與A組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； C、D組與A組比較評(píng)分明顯增高(P<0.05)；D組與C組比較評(píng)分降低(P<0.05)。見表1。

圖1a-d 膝關(guān)節(jié)軟骨肉眼觀察

表1 4組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨大體評(píng)分比較分，

與A組比較，aP<0.05；與C組比較，bP<0.05

2.2 關(guān)節(jié)軟骨光鏡下觀察及改良Mankin評(píng)分 ①HE染色及甲苯胺藍(lán)染色。A組：軟骨表面光滑，細(xì)胞排列有序，數(shù)目正常，HE染色軟骨基質(zhì)著色均勻，潮線完整，甲苯胺藍(lán)著色深藍(lán)，染色均勻，無基質(zhì)失染(圖2-a，圖3-a)。B組：軟骨表面光滑，軟骨細(xì)胞分布均勻，排列有序，形態(tài)正常，甲苯胺藍(lán)著色染色稍有不均，無基質(zhì)失染(圖2-b，圖3-b)。C組：軟骨表面不規(guī)則，部分區(qū)域有絨毛，有裂隙，細(xì)胞排列紊亂，數(shù)目減少，集簇現(xiàn)象明顯，周圍出現(xiàn)大小不等的空陷窩，潮線模糊、斷裂，甚至消失，甲苯胺藍(lán)染色全層基本失染，尤其以表層為重(圖2-c，圖3-c)。D組：軟骨表面較規(guī)則，軟骨細(xì)胞分布欠均勻，排列稍紊亂，可見少量軟骨細(xì)胞簇，細(xì)胞數(shù)目稍減少，潮線較完整，甲苯胺藍(lán)染色稍有不均，表中層可見基質(zhì)失染(圖2-d，圖3-d)。②各組關(guān)節(jié)軟骨改良Mankin評(píng)分： B組與A組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；C、D組與A組比較評(píng)分明顯增高(P<0.05)；D組與C組比較評(píng)分明顯降低(P<0.05)。見表2。

圖2a-d 各組大鼠軟骨HE染色(×100)

圖3a-d 各組大鼠軟骨甲苯胺藍(lán)染色(×100)

表2 4組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨改良Mankin評(píng)分比較分，

與A組比較，aP<0.05；與C組比較，bP<0.05

2.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 ①軟骨細(xì)胞PERK的胞漿著色情況。PERK陽性細(xì)胞表現(xiàn)為軟骨細(xì)胞胞漿呈棕黃色染色。采用IPP圖像分析軟件進(jìn)行分析，測(cè)其平均光密度值。A組：表層偶見少量PERK陽性細(xì)胞(圖4-a)。B組：表層可見少量的PERK陽性細(xì)胞(圖4-b)。C組：全層有散在分布的PERK陽性細(xì)胞,尤以表層及中層多見(圖4-c)。D組：表中層可見散在的PERK陽性細(xì)胞，較C組少(圖4-d)。②各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨PERK平均光密度值比較：B組與A組比較，PERK陽性細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； C、D組與A組比較，PERK陽性細(xì)胞數(shù)明顯增高(P<0.05)；D組與C組比較，PERK陽性細(xì)胞數(shù)降低(P<0.05)。見表3。

圖4a-d 各組大鼠軟骨PERK免疫組化染色(×200)

表3 4組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨PERK平均光密度值比較像素,

與A組比較，aP<0.05；與C組比較，bP<0.05

3 討論

隨著我國(guó)社會(huì)人口的老齡化，骨關(guān)節(jié)炎引起疼痛及活動(dòng)受限給社會(huì)經(jīng)濟(jì)帶來了很大的負(fù)擔(dān)，目前對(duì)于人類骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制尚不明確，且無有效的治療方法，因此研究有效的治療骨關(guān)節(jié)炎的方法越來越迫切。目前骨關(guān)節(jié)炎的常用的治療方法包括：運(yùn)動(dòng)治療、藥物治療、理療、手術(shù)等[11-12]，而水中運(yùn)動(dòng)被強(qiáng)烈推薦用于骨關(guān)節(jié)炎的治療[8]。游泳運(yùn)動(dòng)是一種常見的水中運(yùn)動(dòng)，能提高心肺功能及身體素質(zhì)，延緩關(guān)節(jié)退變[13-14]。同時(shí)由于水的浮力可減少運(yùn)動(dòng)時(shí)由于體重因素造成的對(duì)關(guān)節(jié)的不利影響，與跑步，騎車等陸地運(yùn)動(dòng)相比，游泳時(shí)關(guān)節(jié)軟骨所承受的壓力更小，關(guān)節(jié)軟骨損傷更小[15]。然而目前對(duì)于游泳對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的具體作用機(jī)制還不明確。基于上述原因，我們通過制造大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型，研究游泳訓(xùn)練對(duì)關(guān)節(jié)軟骨退化的影響。

研究證明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展過程中起了重要的作用[1-2]。發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，PERK通路是最先激活也是最重要的通路[16-17]。PERK激活后，阻斷錯(cuò)誤折疊蛋白的合成，減少了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的負(fù)擔(dān),維持了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)平衡，使內(nèi)環(huán)境恢復(fù)穩(wěn)態(tài)，挽救損傷的細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞存活[18]。但是太強(qiáng)或者太長(zhǎng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會(huì)激發(fā)細(xì)胞內(nèi)的凋亡傳導(dǎo)通路，使細(xì)胞發(fā)生凋亡。已有研究證明，在OA的關(guān)節(jié)軟骨中，PERK的表達(dá)增加，且表達(dá)水平與骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度密切相關(guān)，隨著OA程度的增加而增加[5]。雖然PERK在骨關(guān)節(jié)炎中的作用已經(jīng)得到了證實(shí)，但能否通過影響PERK的表達(dá)對(duì)骨關(guān)節(jié)炎起到治療作用仍需要充分的研究。本研究中，通過檢測(cè)PERK探討游泳運(yùn)動(dòng)能否通過影響PERK的表達(dá)而對(duì)骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨的退化起保護(hù)作用，從而對(duì)骨關(guān)節(jié)炎起治療作用。

本研究證實(shí)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中PERK的表達(dá)可能與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示： A、B組僅有少量PERK的表達(dá)，而C組PERK表達(dá)明顯增多，與A組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而C組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示關(guān)節(jié)軟骨的退化程度較A組明顯嚴(yán)重，說明前交叉韌帶切斷聯(lián)合內(nèi)側(cè)半月板部分切除能成功制造骨關(guān)節(jié)炎模型，引起關(guān)節(jié)軟骨的損害，且骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生可能與PERK的表達(dá)增加密切相關(guān)。提示骨關(guān)節(jié)炎大鼠中可能存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，PERK表達(dá)增加，使軟骨細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而使關(guān)節(jié)軟骨退化。

本研究認(rèn)為游泳運(yùn)動(dòng)可能通過降低PERK的表達(dá)對(duì)骨關(guān)節(jié)炎起治療作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：游泳運(yùn)動(dòng)治療后，D組與C組相比，PERK的表達(dá)水平明顯下降，而D組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示關(guān)節(jié)軟骨的退化程度較C組明顯減輕，提示游泳可以延緩關(guān)節(jié)軟骨的退變，對(duì)骨關(guān)節(jié)炎起治療作用，其作用機(jī)制可能為降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減少PERK表達(dá)，減少相關(guān)性軟骨細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)軟骨細(xì)胞，減輕關(guān)節(jié)軟骨退化。但是游泳運(yùn)動(dòng)具體如何使PERK表達(dá)下降，而PERK通過何種途徑影響軟骨細(xì)胞凋亡、防止軟骨退化還不得而知。D組與A組比較，大體評(píng)分、改良Mankin評(píng)分、PERK的表達(dá)均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示每天一次，每次30min，連續(xù)28d的游泳訓(xùn)練尚不能使骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨的損害恢復(fù)正常，使PERK的表達(dá)降至正常。因此能否通過延長(zhǎng)每次訓(xùn)練的時(shí)間及治療周期以改善治療效果還值得進(jìn)一步研究。

通過本研究發(fā)現(xiàn)，游泳運(yùn)動(dòng)可對(duì)骨關(guān)節(jié)炎可起治療作用，其作用可能是通過降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK的表達(dá)實(shí)現(xiàn)。然而本實(shí)驗(yàn)僅選擇了每日1次，1次30min，總共4周的游泳運(yùn)動(dòng)為實(shí)驗(yàn)組，對(duì)于更多不同的游泳運(yùn)動(dòng)時(shí)間、運(yùn)動(dòng)頻率、運(yùn)動(dòng)周期對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的影響等問題需在今后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探討研究，另外，由于實(shí)驗(yàn)人力、物力、財(cái)力等方面的原因，同時(shí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程中死亡或其他意外發(fā)生較多，本實(shí)驗(yàn)樣本量較小，今后的實(shí)驗(yàn)可擴(kuò)大樣本量，同時(shí)從關(guān)節(jié)液、滑膜、軟骨下骨及血清學(xué)指標(biāo)的變化等多方面評(píng)定、驗(yàn)證療效，使結(jié)果更具有說服力。因內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生PERK表達(dá)增加后具體的作用通路，以及通過何種凋亡途徑、如何影響軟骨細(xì)胞的凋亡也沒有在實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行研究，在以后的實(shí)驗(yàn)中我們可從基因水平、細(xì)胞水平進(jìn)一步探討其具體作用機(jī)制。