沙門氏菌檢測能力驗證結果分析

◎ 朱 夢，楊穗珊，林寶英

（海南省食品檢驗檢測中心，海南 海口 571700）

沙門氏菌廣泛存在于自然界中，是一種常見的食源性致病菌，為革蘭氏陰性桿菌，無莢膜和芽孢，屬于腸桿菌科[1]。在中國，每年由沙門氏菌引起的食物中毒占所有細菌性食物中毒事件的70%～80%，由于沙門氏菌菌體溶解時，細胞壁能夠釋放出脂多糖，從而形成內毒素[2-3]，如果食用了污染了沙門氏菌的食物，就容易引起食物中毒，細菌會從腸道侵入血液而遍布全身，引起某些神經癥狀以及肝、腎和心臟病變或至死亡[4-5]。因此，在食品微生物檢驗檢測工作中，對沙門氏菌的檢測意義重大。

本實驗室參加此次國家食品藥品監督管理總局組織的能力考核，結合這幾年微生物檢驗的經驗，能夠分析本次沙門氏菌能力驗證試驗中出現的問題，尋找出解決方案，為以后的檢驗檢測工作提供必要的參考。

1 材料與方法

1.1 樣品

3份考核樣品，編號為CODE0375、CODE0770、CODE0766，每份樣品為一塊瓶裝巧克力，裝量約為10g，采用玻璃瓶包裝。

1.2 培養基及試劑

緩沖蛋白胨水（BPW）、四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液、亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液、亞硫酸鉍（BS）瓊脂、木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂、沙門氏菌顯色培養基、三糖鐵（TSI）瓊脂、營養瓊脂、Swarm瓊脂、半固體培養基、沙門氏菌生化鑒定試劑盒（廣州環凱生物科技有限公司）、VIDAS沙門氏菌（SLM）試劑條，VITEK2革蘭氏陰性細菌鑒定卡（法國梅里埃公司）、沙門氏菌陽性菌株鼠傷寒沙門氏菌（ATCC14028）以及沙門氏菌屬診斷血清（寧波天潤生物藥業有限公司，丹麥SSI公司）。

1.3 實驗方法

按照考核方的作業指導書中的要求處理樣品。樣品處理好以后,依據GB 4789.4-2016《食品全國家標準 食品微生物學 沙門氏菌檢驗》[6]進行實驗，得到疑似純菌落后進行血清分型。全自動熒光免疫分析系統（MINI VIDAS）和全自動微生物生化鑒定系統（VITEK2）作為實驗輔助儀器進行篩選和鑒定，得出實驗結果后報告。

1.3.1 樣品的前處理

在生物安全柜內進行，需要準備90 mL預熱至45 ℃的BPW：首先將滅菌的BPW加入檢樣瓶中，待巧克力融化后再加入無菌均質袋中。取20 mL滅菌的BPW清洗檢樣瓶，將洗液加入均質袋內，再取20 mL滅菌BPW重復清洗一次，最后向均質袋內加入30 mL滅菌BPW，充分均質混勻，制成1∶10稀釋液。依此方法，分別對3件樣品進行前處理。將編好號的BPW增菌液、陽性對照、空白對照一同放入36 ℃培養箱中18 h。

1.3.2 增菌培養

在10 mL TTB 和10 mL SC內，分別轉接1 mL BPW培養物，并分別放入（42±1）℃培養箱和36 ℃培養箱中培養24 h。同時取0.5 mL滅活的BPW增菌液加入到沙門氏菌（SLM）試劑條中，按操作說明書進行操作。

1.3.3 選擇性分離

將TTB、SC增菌液接種到XLD瓊脂平板、BS瓊脂平板和沙門顯色培養基上，放入36 ℃培養箱中，BS瓊脂平板培養48 h，XLD瓊脂平板和沙門顯色培養基培養24 h。培養結束后，觀察平板上的菌落特征，判定有無可疑菌落生長。

1.3.4 生化鑒定實驗

在每個平板上選取3個疑似菌落，接種于三糖鐵（TSI）斜面上，同時接種到營養瓊脂平板上進行純化，36 ℃培養箱中培養24 h。將純化后的菌落用沙門氏菌生化鑒定試劑盒和VITEK2鑒定。

1.3.5 血清學鑒定

先檢查培養物是否有會自凝，在玻片上滴一滴生理鹽水，將菌落涂在水滴中，等待30～60 s后，若出現菌體凝集，則有自凝性。沒有自凝現象的菌落才做血清學鑒定。

（1）O抗原鑒定。O抗原可與相應抗體呈顆粒狀反應。挑取一環待測菌涂在玻片的兩個區域內，分別滴加A～F多價O血清和生理鹽水各一滴，將混合液混勻等待1 min后，觀察是否有凝集現象。被多價O血清凝集后，按照沙門氏菌屬診斷血清說明書中的要求依次凝集OMA、OMB、OMC、OMD，來判定O群。隨后繼續做H抗原凝集實驗。H抗原與對應抗體凝集后呈絮狀，大多數沙門氏菌的H抗原有兩相。如果遇到H相不凝集時，應該先恢復動力。如果恢復動力后還不能凝集，則需誘導后再做。

（2）動力恢復試驗。取疑似菌落，接種到半固體瓊脂上，取菌落最邊緣的部分進行凝集試驗。

（3）平板誘導法。加入1～2滴已凝集的誘導血清至Swarm培養基中，混合均勻，將待凝集菌株接種到板中央，36 ℃培養箱中培養12 h。挑取菌落最邊緣的部位進行H相鑒定。

2 結果與分析

2.1 MINI VIDAS全自動熒光免疫分析結果

MINI VIDAS的檢測結果為陽性對照鼠傷寒沙門 氏 菌（ATCC14208）、CODE0375、CODE0770、CODE0766均為沙門氏菌陽性（見表1）。

表1 MINI VIDAS檢測結果表

2.2 增菌后選擇性分離的結果

增菌劃線分離后，平板觀察結果，編號為CODE0375、CODE0770、CODE0766的培養基平板上均出現可疑菌落特征。各平板上菌落特征結果見表2。

表2 選擇性培養基上的菌落特征表

2.3 生化實驗和VITEK2鑒定結果

將純化后的菌落進行生化實驗和VITEK2鑒定，結果均與沙門氏菌屬生化特性一致，詳細結果見表3。

表3 生化實驗和VITEK2鑒定結果表

2.4 血清分型結果

參照GB 4789.4-2016中血清學分型鑒定要求對CODE0375、CODE0770、CODE0766三個樣品進行血清分型，結果見表4。

表4 血清分型結果表

3 結論與討論

能力驗證是保證實驗室檢測結果質量的一種必要手段。各個實驗室參與能力驗證，可了解承檢實驗室的檢測能力，保證檢測結果的準確性，從而提高各個實驗室的檢測水平，確保檢測質量[7-8]。各個實驗室通過參加能力驗證，可以發現自身在檢驗工作中存在的問題，并進行改進和糾正[9]。

此次能力驗證本實驗室除了按照GB 4789.4-2016規定的方法鑒定以外，還運用了全自動熒光免疫分析結果（MINI VIDAS）作為輔助，對樣品進行初篩。MINI VIDAS可以直接使用增菌液上機檢測，避免人工檢測過程中造成假陰性，可與傳統方法相互補充，防止漏檢[10]。在本次實驗中，為了保證實驗結果的準確性，采用了國產寧波天潤和丹麥SSI公司兩種品牌的血清相互驗證[11]。沙門顯色培養基對沙門氏菌屬有很高的特異性，對沙門菌種的分離和判定都有很大的幫助，對一些與沙門氏菌很相似的變形桿菌都能夠很直觀地區分開[12-13]。

在整個實驗的過程中，一定要注意對所有試劑進行驗收，驗收合格以后才能使用。按照GB4789.28-2013《食品微生物學檢驗 培養基和試劑的質量要求》來進行驗收[14]。目前食品微生物的檢驗方法有傳統檢驗方法，免疫學法和分子生物學檢測法三種。這三種方法各有優點，在檢驗工作中可相互補充和輔佐，以提高檢驗的準確性。