UPLC-MS/MS法測定面粉中草甘膦殘留量的不確定度評定

◎ 王紫昕，朱 捷，馮秀娟

（寧夏食品檢測研究院，寧夏 銀川 750000）

草甘膦（Glyphosate）純品為非揮發性白色固體，大約在230 ℃熔化，并伴隨分解。25 ℃時在水中的溶解度為1.2%，不溶于一般有機溶劑，其異丙胺鹽完全溶解于水。不可燃、不爆炸，常溫貯存穩定，是一種非選擇性、無殘留滅生性除草劑，對多年生根雜草非常有效，廣泛用于種植行業。其殘留含量的檢測原理是通過試樣用水提取，經固相萃取柱凈化，與9-芴基甲基三氯甲烷衍生化反應后，用液相色譜-質譜/質譜測定，內標法定量。

1 實驗參數與條件

1.1 設備、試劑

材料：各大商超及小型店鋪售賣的面粉。設備：超高相液相色譜-質譜聯用儀（Waterstqsmicro）。標準品：草甘膦標準品99.0%；氨甲基膦酸標準品98.0%；同位素內標1,2-C13N15標準溶液，100 μg/mL。

試劑：二氯甲烷（AR）、甲醇（AR）、鹽酸（AR）、9-芴基甲基三氯甲烷（FMOC-CL）≥99.0%、丙酮（AR）。

1.2 檢測方法

1.2.1 液相色譜洗脫條件

表1 液相色譜洗脫條件表

1.2.2 質譜條件

離子源，ESI；模式，正模式；檢測方式，MRM；干燥器溫度：325 ℃；干燥器流量：7 L/min；噴霧器壓力：275.8 kPa；EMV（+），300；鞘氣溫度：350 ℃；鞘氣流量：11 L/min。

1.2.3 標準使用液

準確稱取各標準物質于10 mL聚乙烯容量瓶中，用水溶解，加入2滴鹽酸，并用水定容至刻度，配制為1.0 mg/mL的標準儲備液。

準確吸取濃度為100.0 μg/mL的1,2-13C15N草甘膦內標標準溶液1.0 mL至10 mL聚乙烯容量瓶中，用水定容至刻度，配制成10.0 μg/mL的同位素標準工作液。

準確吸取適量混合標準儲備液和同位素內標工作溶液，用水配制成5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 ng/mL的混合標準工作液，其中同位素內標濃度為25 ng/mL。

1.3 樣品前處理

稱取5 g樣品于100 mL離心管中，加入0.25 mL內標工作液，加入40 mL水、20 mL二氯甲烷，高速勻質2 min，4 000 r/min離心5 min，取上清液于100 mL聚乙烯容量瓶中，殘渣再加入40 mL水重復提取一次，合并上層水溶液并定容至100 mL，帶凈化。C18小柱用5 mL甲醇、10 mL水活化后加入上述水溶液，棄去1～2 mL初濾液后接收。準確移取1.0 mL濾液與標準溶液一同加入200 μL 5%硼酸鹽緩沖液，混勻，加入200 μL 1.0 g/L的FMOC-Cl溶液，混勻，40 ℃下衍生化反應，放置過夜，衍生后的溶液過濾膜，供超高相液相色譜-串聯質譜儀測定。

2 不確定度的來源

2.1 數學模型的建立

面粉中草甘膦含量測定按公式（1）計算：

式（1）中，X為面粉中草甘膦的含量，mg/kg；C為由標準曲線得出的樣液中待測物的濃度，ng/mL；C0為試劑空白，ng/mL；V為試樣定容體積，mL；m為試樣的質量，g。

2.2 標準溶液濃度引入的不確定度

草甘膦標準不確定度：

2.3 標準儲備液配制過程中稱量引入的不確定度

草甘膦標準儲備液。

氨甲基膦酸標準儲備液。

2.4 稀釋過程引入的不確定度

標準工作曲線是由準確吸取適量混合標準儲備液和同位素內標工作溶液，用水配制成5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 ng/mL的混合標準工作液，其中同位素內標濃度為25 ng/mL。

繪制標準工作曲線過程中使用了一系列玻璃量具，按照JJG 196-2006《常用玻璃量具檢定規程》的要求，均有相應的最大允差，按照三角分布考慮，k=，由此估算相對不確定度分量，見表1。

表1 標準系列配制過程中量具校準引起的不確定度表

草甘膦標準系列配制中引入的不確定度：

2.5 線性擬合得出質量濃度的不確定度

草甘膦最小二乘法擬合標準溶液質量濃度-峰面積結果，見表2。

表2 草甘膦最小二乘法擬合標準溶液質量濃度-峰面積結果表

采取面粉提取液測試10加標回收值，方程求得的平均質量濃度為D1=21.18 ng /mL時，則D1的標準不確定度：

式（2）中：

標準系列的平均濃度水平；

則X0的相對標準不確定度：

最小二乘法擬合氨甲基膦酸標準溶液質量濃度-峰面積結果，見表3。

表3 最小二乘法擬合氨甲基膦酸標準溶液質量濃度-峰面積結果表

本例中對面粉測定液進行了10次加標回收測定，由直線方程求得的平均質量濃度為D2=27.16 ng/mL時，則X2的標準不確定度：

式（3）中：

標準溶液的平均濃度；

n為18；N為10次。

則X2的相對標準不確定度：

2.6 樣品制備

2.6.1 取樣

按SN/T 1923-2007的規定，準確稱量至0.01 g，稱樣量為5.0 g，JJG 1036-2008《電子天平檢定規程》規定，兩次稱量天平不確定度：

2.6.2 定容體積的標準不確定度

稱取5 g樣品于100 mL離心管中，加入0.25 mL內標工作液，加入40 mL水、20 mL二氯甲烷，高速勻質2 min，4 000 r/min離心5 min，取上清液于100 mL聚乙烯容量瓶中，殘渣再加入40 mL水重復提取一次，合并上層水溶液并定容至100 mL，帶凈化。C18小柱用5 mL甲醇、10 mL水活化后加入上述水溶液，棄去1～2 mL初濾液后接收。準確移取1.0 mL濾液與標準溶液一同加入200 μL 5%硼酸鹽緩沖液，混勻，加入200 μL 1.0 g/L的FMOC-Cl溶液，混勻，40 ℃下衍生化反應，放置過夜，衍生后的溶液過濾膜，供超高相液相色譜-串聯質譜儀測定。

100 mL容量瓶校準引入的標準不確定度為：

1 mL刻度試管由校準引入的標準不確定度為：

1 000 μL移液器由校準引入的標準不確定度為：

1 000 μL移液器由校準引入的標準不確定度為：

2.6.3 樣品制備過程中的不確定度

2.7 復現性

同等條件下，對草甘膦試樣中所含含量進行了10次獨立性檢測，結果見表4。

表4 草甘膦含量10次測定結果表

在同等條件下，對草甘膦樣品進行10次檢測，其含量算數平均值為：

單次測定的標準偏差為：

算數平均值不確定度：

3 草甘膦各不確定度來源結果

草甘膦含量不確定度來源結果表，見表5。

表5 草甘膦含量不確定度來源結果表

3.1 合成標準不確定度

面粉中草甘膦測量的合成標準不確定度基于公式計算如下：

3.2 擴展不確定度

試樣中草甘膦的擴展不確定度的取K=2，擴展不確定度為：

相對擴展不確定度：

結果：當K=2時，Y=(0.955 8±0.086 2)mg/kg

4 結論

本實驗通過對面粉中草甘膦殘留量不確定度的來源進行分析，并對各個分量進行了精細的計算，從結果可以發現，由于實驗需采取衍生法進行實驗，在衍生化的過程中，線性相關性的不確定來源相對較大，在同等條件下的復現性測試過程中所引起的不確定度次之。所以，通過草甘膦的不確定度的計算，可以促使在實驗過程中應該更加精細化、精準化操作，使草甘膦殘留量的不確定度降低。此外，在實驗過程中，草甘膦的不確定來源分析與結果，提示工作人員在操作過程相對復雜的實驗中，需操作人員的耐心與專業才能更好地完成實驗。總的來說，本方法為更好地進行食品中草甘膦殘留量的測定提供了有效的數據分析與結論。