高效液相色譜分析法同時(shí)檢測(cè)食品中的5種添加劑

◎ 黎 東

（南充市食品藥品檢驗(yàn)所，江西 南充 637000）

隨著人們生活水平的提高，各種外形新奇、口味鮮美的食品成為市場(chǎng)主角。食品添加劑在食品生產(chǎn)加工中具有重要作用。GB 2760-2014中規(guī)定了2 000種以上的食品添加劑限量要求。山梨酸、苯甲酸、脫氫乙酸作為廣譜防腐劑，能抑制多種霉菌細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖。安賽蜜及糖精鈉是人工合成甜味劑，是糕點(diǎn)中常用的食品添加劑。一些廠商為改善口味，延長(zhǎng)保質(zhì)期，常違規(guī)使用這些防腐劑與甜味劑，其對(duì)人體健康有不同程度的危害。為保證食品質(zhì)量安全，建立快速高效的檢測(cè)方法具有重要意義。

本文研究了液相色譜法測(cè)定食品中的5種添加劑的方法，探索了色譜條件對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，建立了相應(yīng)的檢測(cè)方法。研究結(jié)果：采用液相色譜法能同時(shí)定性定量分析食品中的山梨酸、苯甲酸、脫氫乙酸、糖精鈉、安賽蜜。測(cè)定條件：色譜柱ZORBAX SB-C18柱分離，甲醇∶0.02 mol/L乙酸銨溶液=5∶95為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm。5種添加劑為400 μg/mL時(shí)相關(guān)性良好。最小檢出限介于0.196～1.452 mg/kg。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差＜5%，回收率＞90%，該方法檢測(cè)快捷高效，便于檢測(cè)人員對(duì)食品中5種添加劑含量情況作出快速判斷。

1 食品添加劑簡(jiǎn)述

食品添加劑是為改善食品品質(zhì)，為防腐與加工工藝需要加入的人工或天然物質(zhì)。目前，我國(guó)食品添加劑有2 000多種。

防腐劑在食品加工中主要用于防止食品腐敗變質(zhì)，防腐劑超量使用會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生毒副作用。考慮到食品安全，食品防腐劑的定性定量檢測(cè)非常重要。國(guó)內(nèi)目前對(duì)食品防腐劑檢測(cè)為針對(duì)某一類食品的一種防腐劑進(jìn)行檢測(cè)，而對(duì)超范圍添加的非法添加物不能有效檢測(cè)。目前，我國(guó)糧食損失約占10%，肉類食品損失在30%左右。食品帶菌嚴(yán)重，致使疾病蔓延。傳統(tǒng)食品保藏技術(shù)能夠延長(zhǎng)食品保質(zhì)期，但破壞了食品營(yíng)養(yǎng)成分。隨著能源的大量使用，產(chǎn)生了環(huán)境污染問(wèn)題。防腐劑能有效延緩食品變質(zhì)，保護(hù)食品資源不受損失，保證食品在市面流通時(shí)不因微生物污染而危害人體健康。食品防腐劑能防止由微生物引起的腐敗變質(zhì)，兼有防止微生物繁殖引起食物中毒的作用。衛(wèi)生部頒布的《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》嚴(yán)格規(guī)定了食品添加劑的添加范圍，為食品生產(chǎn)企業(yè)提供了食品生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范，為保證食品添加劑的安全使用發(fā)揮了重要作用。嚴(yán)格遵循標(biāo)準(zhǔn)使用添加劑，會(huì)減輕微生物污染與營(yíng)養(yǎng)不均衡的危害[1]。

人們對(duì)健康的要求越來(lái)越高，希望食品中的甜味劑盡可能低甚至為零。甜味劑指賦予食品或飼料以甜味，滿足人們對(duì)食品要求的食物添加劑。合格的甜味劑對(duì)人體沒(méi)有影響，但是長(zhǎng)期攝入甜味劑會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生危害。甜味劑應(yīng)具備安全性高、穩(wěn)定性好、價(jià)格合理等特點(diǎn)。

食品樣品前處理是食品檢測(cè)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。高效快速的樣品制備與檢測(cè)技術(shù)研究成為現(xiàn)代分析化學(xué)的熱點(diǎn)之一。目前，食品添加劑檢測(cè)方法主要是色譜法，因?yàn)樯V方法成本低，易操作。

2 高效液相色譜法

液相色譜法最早出現(xiàn)于1903年，20世紀(jì)60年代，氣相色譜理論技術(shù)應(yīng)用到液相色譜中。高效液相色譜法可以分析用氣相色譜難以分析的物質(zhì)，其應(yīng)用范圍遠(yuǎn)超氣相色譜。液相色譜檢測(cè)器具有多樣性，其基本原理為溶質(zhì)物理化學(xué)性質(zhì)與流動(dòng)相有差異，在色譜圖上以色譜峰的形式記錄，當(dāng)溶質(zhì)從色譜柱流出時(shí)，會(huì)導(dǎo)致流動(dòng)相背景值發(fā)生變化。

高效液相色譜法采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑等流動(dòng)相泵入色譜柱，由流動(dòng)相帶入柱內(nèi)，各成分被分離后進(jìn)入檢測(cè)器檢測(cè)。僅根據(jù)保留時(shí)間對(duì)未知樣品定性較為困難，僅靠色譜本身不能對(duì)未知的化合物進(jìn)行定性，相應(yīng)信號(hào)缺乏典型的分子結(jié)構(gòu)特征，只能鑒定已知的化合物。

定量分析目的是求出樣品中被分析物的含量，組分在流動(dòng)相中濃度與檢測(cè)器相應(yīng)信號(hào)成正比。樣品中雜質(zhì)定量檢測(cè)方法，驗(yàn)證需測(cè)定其準(zhǔn)確性、精密性、線性等5個(gè)指標(biāo)[2]。

3 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

3.1 實(shí)驗(yàn)材料與實(shí)驗(yàn)方法

3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

①實(shí)驗(yàn)原料為市售飲料、調(diào)味品等。②實(shí)驗(yàn)儀器包括安捷倫1260高效液相色譜儀，自動(dòng)進(jìn)樣器，PURELAB flex超純水機(jī)，高速冷凍離心機(jī)，超聲波清洗儀。③主要試劑包括甲醇、乙酸銨、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀。標(biāo)準(zhǔn)樣品為苯甲酸、糖精鈉、山梨酸、脫氫乙酸（生產(chǎn)廠家德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH，純度=99.9%），安賽蜜（生產(chǎn)廠家德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH，純度=99%）。相關(guān)參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 5種添加劑的相關(guān)計(jì)算數(shù)據(jù)表

3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

①脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。稱取脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品0.101 0 g，以NaOH溶液（20 g/L）溶解，得到濃度為1.0 mg/mL的脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。②混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。將含苯甲酸、山梨酸、安賽蜜、糖精鈉等添加劑的溶液稀釋配制成待用混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。③亞鐵氰化鉀溶液。在燒杯中取106 g亞鐵氰化鉀，轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶中，定容備用。④乙酸鋅溶液。在燒杯中稱取220 g乙酸鋅，轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶中，定容備用，0.02 mol/L。⑤乙酸銨溶液。稱取1.54 g乙酸銨，轉(zhuǎn)移至1 000 mL溶液瓶中，經(jīng)抽濾超聲波脫氣后備用。相關(guān)參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 不同食品中5種添加劑參數(shù)表

3.1.3 色譜條件

色譜柱，ZORBAX SB-C18柱，檢測(cè)器掃描提取230 nm波長(zhǎng)。柱溫30 ℃，甲醇-0.02 mol/L乙酸銨溶液。進(jìn)樣量10 μL，流速1.0 mL/min。

3.1.4 樣品前處理

稱取5 g（精確至0.001 g）樣品至小燒杯中，轉(zhuǎn)移到50 mL的容量瓶中。3次清洗燒杯后將樣品置入容量瓶中。先后加入乙酸鋅及亞鐵氰化鉀3 mL，超聲波提取15 min，4 000 r/min離心5 min，吸取上清液濾膜至進(jìn)樣瓶中待檢。

3.1.5 定性定量方法

將配制好的5種添加劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至不同濃度。經(jīng)液相色譜分析，由出峰時(shí)間定性，峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度作為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算目標(biāo)樣品物含量為5 g[3]。

3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 色譜柱的選擇

試驗(yàn)考察了ZORBA× SB-C18（5 μm，4.6 mm×150 mm）液相色譜柱，ZORBA× SB-C18（5 μm，4.6 mm×150 mm）液相色譜柱色譜柱長(zhǎng)分析時(shí)間長(zhǎng)，色譜柱過(guò)短，導(dǎo)致5種添加劑分離不完全。最終選擇ZORBA×SB-C18柱（5 μm，4.6 mm×150 mm）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

安捷倫1260高效液相色譜儀DAD二極管陣列檢測(cè)器可全波長(zhǎng)掃描目標(biāo)化合物。將波長(zhǎng)設(shè)置在190～400 nm，最終確定5種食品添加劑檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm。

3.2.3 流動(dòng)相的優(yōu)化

甲醇-0.02 mol/L乙酸銨溶液為流動(dòng)相，（甲醇 ∶ 乙 酸 銨 溶 液 =80∶ 20、85∶ 15、90∶ 10、5∶95），最終確定甲醇乙酸銨溶液為5∶95時(shí)5種添加劑分離效果最好。

3.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以檢測(cè)結(jié)果的3倍信噪比計(jì)算檢出限80%。該方法比中國(guó)國(guó)家液相色譜法標(biāo)準(zhǔn)有更高的靈敏度。

3.2.5 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)精密度

選取糕點(diǎn)、飲料為檢測(cè)對(duì)象，作加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。采用該方法檢測(cè)以上基質(zhì)均有良好的回收率，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）值均小于7%。該方法具有較高的精密度及較廣泛的適用范圍。

3.2.6 基質(zhì)適用性分析

選用市售飲料等具有代表性的食品樣品進(jìn)行防腐劑和甜味劑檢測(cè)，可同時(shí)檢測(cè)多種類型樣品中的防腐劑和甜味劑。

3.3 實(shí)驗(yàn)討論

提取需確定所有目標(biāo)分析物在分層提取中的分配系數(shù)，確保目標(biāo)分析物在液液萃取時(shí)有較高回收率。將防腐劑、甜味劑標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液加入互不溶的溶劑中，用液相色譜檢測(cè)不互溶防腐劑含量，檢測(cè)各萃取溶劑中目標(biāo)分析物濃度比，估算防腐劑和甜味劑溶劑分配。利用亞鐵氰化鉀和乙酸鋅溶液除去食品基質(zhì)中的蛋白質(zhì)雜質(zhì)，發(fā)現(xiàn)對(duì)防腐劑和甜味劑的回收率影響不大。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了同時(shí)檢測(cè)多類型食品中苯甲酸、安賽蜜、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸的方法。采用ZORBAX SB-C18柱（5 μm，4.6 mm×150 mm）分析，流動(dòng)相為甲醇∶乙酸銨溶液（0.02 moL/L）=5∶95，流速為1.0 mL/min，230 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，該方法檢測(cè)食品類別涵蓋范圍較廣，具有經(jīng)濟(jì)高效安全等特點(diǎn)，能同時(shí)檢測(cè)不同食品中的防腐劑和甜味劑。