老年根齲患者唾液菌群多樣性初步分析

楊會肖 呂胡玲 陳慧姍 吳紅崑

根齲是老年人群中常見的口腔疾患，據(jù)第三次全國口腔健康流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國65～74歲的老年人群中根齲的患病率高達63.6%[1]。根齲進展迅速，治療不及時常常會累及牙髓或根尖周組織，造成疼痛，甚至失牙，嚴重危害老年人的口腔及全身健康，降低生活質(zhì)量[2]。目前公認的齲病致病機制為口腔菌群失衡學(xué)說[3-4]，該學(xué)說認為：某些口腔微生物產(chǎn)酸引起牙面環(huán)境酸化，口腔微生態(tài)環(huán)境發(fā)生改變，產(chǎn)酸或耐酸菌的定植增加，引起牙齒表面脫礦與再礦化過程發(fā)生失衡，導(dǎo)致牙體硬組織崩解和牙本質(zhì)的有機基質(zhì)暴露；同時，酸環(huán)境還可以活化機體內(nèi)的蛋白酶導(dǎo)致暴露的牙本質(zhì)基質(zhì)不斷發(fā)生降解?？谇晃⑸锞旱南嗷プ饔霉餐龠M了齲病的發(fā)生及發(fā)展。

目前，已知人類口腔中存在的細菌約700種[5]，其中超過一半是用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)無法培養(yǎng)的。Preza等[6]利用克隆測序的方法對根齲牙菌斑進行研究發(fā)現(xiàn)，除了變異鏈球菌、乳酸桿菌及放線菌外，糞腸球菌、阿托波菌、歐陸森氏菌、擬溶半乳桿菌、Pseudoramibacter alactolyticus，以及丙酸桿菌屬和月形單胞菌屬的個別細菌株均與根齲的發(fā)生密切相關(guān)，揭示了根齲相關(guān)細菌的復(fù)雜性和多樣性；但其他研究卻得出了不同的結(jié)論[7-8]，因此，有必要對根齲相關(guān)細菌進行進一步的探討。

唾液是口腔內(nèi)細菌的天然載體，是形成牙菌斑的外部環(huán)境。已有的研究表明，唾液中微生物的種類決定了牙面上菌群的定植模式[9]，罹患牙周病或齲病的人群，其唾液微生物群落與健康人存在顯著差異[10]；同時唾液微生物群落結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，唾液取樣簡單，無痛，具有無創(chuàng)性，因此，常常被用于口腔微生物多樣性的研究[11]。但目前這些研究多集中于兒童或中年人，且主要針對冠部齲，目前，尚未見到有關(guān)根齲與唾液微生物群落組成關(guān)系的研究。

區(qū)別于傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，以聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)為基礎(chǔ)的高通量方法如變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)，可以不必對原始樣本進行培養(yǎng)而直接提取基因組DNA，分析細菌群體在基因水平和代謝水平上的多樣性，監(jiān)測微生物群落的動態(tài)變化，以及發(fā)現(xiàn)新的口腔微生物物種等[12]。本研究采用PCR-DGGE指紋圖譜技術(shù)初步探討不同根齲狀況的老年人唾液微生物群落的多樣性變化，尋找根齲相關(guān)優(yōu)勢菌群，期望為老年人根齲的預(yù)測及防治提供一定理論依據(jù)。

1.材料與方法

1.1臨床材料 隨機抽樣總體為參加2012年5月～2013年7月度四川大學(xué)華西醫(yī)院全身體格檢查的65歲以上老年人，年齡65～92歲。實驗分為2組：根齲組：根齲牙面數(shù)(Root caries surface,RDS)≥1，n=10；健康對照組：n=10。根齲的診斷標準[13]為：齲損質(zhì)軟或皮革感，齲損位于根面上或釉牙本質(zhì)界處但大部分位于根面上，包括原發(fā)齲和繼發(fā)齲。總納入標準：全身健康狀況良好，精神狀況正常，無長期服藥史，未罹患糖尿病、高血壓、舍格倫綜合癥等系統(tǒng)性疾病，未接受頭頸部術(shù)后放化療等，采樣前2個月未服用抗生素，抗菌漱口液及免疫抑制劑，口腔衛(wèi)生較好，牙齦健康，除根齲外，無其他明顯口腔感染性疾病如牙周病、牙髓炎、口腔黏膜疾病及腫瘤等，剩余牙數(shù)大于18顆，無長烤瓷橋修復(fù)。

1.2樣本采集 經(jīng)四川大學(xué)華西醫(yī)院倫理道德委員會批準，研究對象或其監(jiān)護人在取樣前均簽署知情同意書。由同一名操作者于上午8時左右分別收集2組人群非刺激性全唾液2～3mL，取樣前均禁水禁食，自然口含唾液數(shù)分鐘后讓唾液自行流入無菌EP管中，-80℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 DNA的提取和PCR擴增 將唾液樣本在室溫下化凍，離心，收集細菌沉淀。使用Master PureTMDNA Purification Kit(Epicentre Biotechnologies公司，美國)提取唾液樣本中細菌全基因DNA作為模板。選用通用引物Bac1和Bac2對細菌的16Sr RNA基因V3區(qū)進行擴增，其中Bac1引物5′端連接40bp的“GC夾”，序列如下。Bac1:5′-CGCCCG CCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCG CCC GAC TAC GTC CCA GCA GCC-3′，Bac2:5′-GGA CTA CCA GGGTAT CTA ATCC-3′，擴增產(chǎn)物長度約為300bp。2%普通瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.4變性梯度凝膠電泳 (DGGE)PCR擴增產(chǎn)物通過DCodeTMUniversal Mutation檢測系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國)進行變性梯度凝膠電泳[12]。聚丙烯酰胺凝膠質(zhì)量分數(shù)為8%(w/v)，變性劑濃度梯度質(zhì)量分數(shù)為30%～70%。電壓恒定條件下，在1×TAE緩沖液(pH 8.5)中電泳16h。電泳完成后，溴化乙錠的染色，后于凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國)采集DGGE凝膠的數(shù)碼圖像。

1.5 DGGE凝膠圖像分析 采用Quantity One1-D分析軟件4.6.2(Bio-Rad公司，美國)對電泳圖像進行分析。DGGE圖譜進行優(yōu)化處理后，識別、調(diào)整泳道及條帶，進行條帶配對，并對圖譜中的條帶進行半定量分析，采用豐富度(S)和Shannon-Wieners指數(shù)(H’)反應(yīng)群落的多樣性。使用非加權(quán)平均法(unweighted pair-group method with arithmetic mean,UPGMA)進行聚類分析構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.6切膠回收及序列測定 選擇特征性條帶進行切膠回收，回收產(chǎn)物以Bac1/Bac2通用引物進行再富集，擴增產(chǎn)物送大連TaKaRa生物公司進行克隆、測序。測序結(jié)果于人類口腔微生物組數(shù)據(jù)庫(HOMD，http://www.homd.org)，美國國立生物信息中心(NCBI，http://ncbi.nlm.nih.gov)和RDPⅡ數(shù)據(jù)庫(Ribosomal database project，http://rdp.cme.msu.edu)中進行BLAST檢索比較，一致性達到98%-100%的序列被認為具有陽性指示意義。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS13.0軟件，采用單因素方差分析(ANOVA)比較組間豐富度(S)及Shannon-Wieners指數(shù)(H’)差異，顯著性水檢驗標準為P＜ 0.05。

2.結(jié)果

2.1 DGGE圖譜總體特征 根齲與無齲組老年人群唾液微生物群落的DGGE圖譜見圖1，每個電泳條帶代表1個樣本，同一位置水平的條帶代表1種細菌的基因型。實驗具有可重復(fù)性，Sorensons相似系數(shù)為0.87。兩組人群唾液細菌的組成具有多樣性和個體差異性，圖譜表現(xiàn)為未見到完全相同的泳道出現(xiàn)。

圖1 唾液菌群的PCR-DGGE圖譜

3.2條帶類型分析 共發(fā)現(xiàn)34個不同類型的條帶(圖2，Band type1-34)，各泳道條帶數(shù)介于16～28之間，平均條帶數(shù)為19.85±2.56。其中有9個條帶(Band type 1,3,13,16,20,21,22,23,24)在約80%以上樣品中都有出現(xiàn)，其中Band type3,13,16,21的檢出率為100%，推測它們可能是老年人群口腔常駐菌群；6個條帶在兩組的分布有顯著差異，其中band type 5,27,32在健康組的絕大多數(shù)樣本里均能檢出(檢出率，5(90%)，27(90%)，32(80%))，而在根齲組檢出減少(檢出率，5(50%)，27(40%)，32(40%))。Band type 25在根齲組的檢出率為100%，在健康組僅檢出2例(檢出率，20%);而band14，34在根齲檢出率均達到80%，在健康組的檢出頻率則下降至30%，甚至更低(檢出率，14(30%)，34(20%))。這6個條帶分別對應(yīng)圖1中A,B,C,E,D,F,切膠回收后進行克隆測序。

圖2 條帶類型分析圖

2.3多樣性分析 采用豐富度(S)和Shannon-Weaver指數(shù)(H’)來分析2組人群的多樣性。物種豐富度(species richness,S)是指群落所包含的物種數(shù)目，表明群落或微生態(tài)環(huán)境中物種數(shù)目的多寡[14]。本實驗中豐富度以泳道中所有條帶數(shù)目表示。H’的計算是基于DGGE凝膠條帶的位置和條帶的強度(圖3)，計算公式為H′=∑piln(pi),(pi=ni/N)，其中ni為單個條帶的光密度，N為所有條帶的光密度[14]。老年無齲組唾液細菌的豐富度SNRC為20.90±2.92，而根齲組老年人唾液細菌的平均條帶數(shù)SRC為18.80±1.69，但兩組豐富度無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(SNRC：SRC，P=0.103)；根齲組和無齲組老年人唾液菌群的Shannon-Wieners指數(shù)(H’)則分別為2.52±0.17和2.73±0.1，兩者之間的差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

圖3 DGGE圖譜各條帶相對強度的數(shù)字化示意圖

3.4 UPGMA分析 UPGMA聚類分析結(jié)果(圖4)表明，除泳道16和19外，健康組內(nèi)大部分樣本(泳道 18，14，12，20，11，15，17，13)聚類到鄰近位置，Dice’s相似系數(shù)為0.61；而根齲組除了泳道1和7外，大部分樣本，(泳道2-6，8，9，10)亦聚類到鄰近的不同位置，兩組人群唾液微生物群落結(jié)構(gòu)都表現(xiàn)出較高內(nèi)部相似性。

圖4 UPGAM系統(tǒng)發(fā)育樹

3.5條帶回切測序結(jié)果 A-F每個條帶選取2個陽性克隆進行測序，得到了種屬、甚至株級別的微生物信息，測序匹配度高達98%以上(表1)。異發(fā)酵乳桿菌DSM5705(Lactobacillusmalefermentans strain DSM 5705)、未獲培養(yǎng)的真細菌屬克隆clone IS017B74/IS013B55(Uncultured Eubacterium sp clone IS017B74/IS013B55)及頰纖毛菌C-1013-b(Leptotrichia buccalis C-1013-b)在根齲組檢出率高于正常組；而副流感嗜血桿菌T3T1(Haemophilus parainfluenzae T3T1),奈瑟菌屬11-26360(Neisseria sp.11-26360)和某種未獲培養(yǎng)的細菌(Uncultured bacterium clone ncd2240d01c1)在正常組檢出較頻率更高。

表1 回切條帶測序比對結(jié)果

3.討論

根面齲是老年口腔疾患中最常見、危害較大的疾病之一，它具有廣泛的流行性，臨床損害的特殊性及防治的復(fù)雜性，需要特別注意?？谇晃⑸锞号c宿主的相互作用同口腔疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，以群落和微生物生態(tài)為基礎(chǔ)對口腔微生物菌群進行探討不僅為理解根齲的病因?qū)W提供了新的視角，也為根齲的防治提供了新的手段。

本研究采用PCR-DGGE技術(shù)對根齲及口腔健康老年人唾液微生物群落進行總體分析，DGGE指紋圖譜共獲得34種不同位置的條帶，直觀地顯示了不同個體唾液微生物的組成具有多樣性及差異性。DGGE圖譜分析發(fā)現(xiàn)，老年根齲組的口腔微生物豐富度較老年健康組有減少的趨勢(組SRC=18.80±2.94；SNRC=20.90±2.51)，但差異不明顯；而老年根齲患者唾液菌群的另一多樣性指數(shù)-Shannon-Wieners指數(shù)(H’)(H’RC=2.52±0.17；H’NRC=2.73±0.18)則顯著小于正常者。因為Shannon指數(shù)除了包括種數(shù)外，還包括各種間個體分配的均勻性(equability或evenness)。各種之間，個體分配越均勻，H’值就越大。如果每一個體都屬于不同的種，多樣性指數(shù)就最大；如果每一個體都屬于同一種，則其多樣性指數(shù)就最小，因此與豐富度的簡便直觀相比，Shannon指數(shù)更能真實地反映多樣性，因此，我們認為老年根齲患者唾液微生物菌落多樣性減少。根齲組唾液細菌的多樣性較正常組有減少的趨勢，這與Li等[15]的研究結(jié)果一致。而條帶類型分析則發(fā)現(xiàn)，6個條帶(band type 5,27,32,25,14,34)在兩組人群唾液中均可檢出，但檢出頻率差異較大。這些發(fā)現(xiàn)都再次驗證了齲病的口腔菌群生態(tài)失衡學(xué)說，即齲病的發(fā)生并不是由于某種致病菌的出現(xiàn)或者整個口腔微生物數(shù)量增多導(dǎo)致，而是隨著口腔微生態(tài)環(huán)境的改變，導(dǎo)致一部分細菌的生長繁殖被抑制，數(shù)量減少或消失，而另一部分細菌則大量繁殖，轉(zhuǎn)變?yōu)闂l件致病菌，從而導(dǎo)致齲齒的發(fā)生[16]。

結(jié)合特征條帶測序結(jié)果，研究發(fā)現(xiàn)，頰纖毛菌C-1013-b(band type25)可以在老年根齲組唾液樣本中100%被檢出，這與Ling等[17]針對兒童齲病患者唾液菌群的研究一致。已知頰纖毛菌可以與韋榮菌及變鏈菌發(fā)生共聚，作為它們黏附于牙面的支架[18]。但Preza等則發(fā)現(xiàn)在健康根面菌斑中纖毛菌的檢出比例更高[11]。但頰纖毛菌C-1013-b是可以培養(yǎng)的，因此使得對它的理化性能及其與根齲的關(guān)系進行進一步探討成為可能。已知真細菌包含較多種類，有學(xué)者指出Eubacterium saburreum可以與Veillonella spp.發(fā)生共聚幫助其黏附到牙面上導(dǎo)致齲病的發(fā)生[19]，但也有研究指出Eubactrium.saburreum clone GT038，Eubacterium sp.clone EI074，Eubacterium sp.clone DO016等與口腔健康密切相關(guān)[20]，提示我們不同的細菌株可能具有完全不同的生物特性，因此，有必要從基因型水平對微生物的毒力因子進行探討。本研究發(fā)現(xiàn)，某種未獲培養(yǎng)的真細菌屬克隆clone IS017B74/IS013B55(band type 34)在根齲組樣本中的檢出率高于健康人群，這與Preza等所得出的結(jié)論一致[11]，同時這些種屬級別，甚至株級別微生物信息的獲得，也證實了DGGE在研究微生物多樣性方面的實用性。另外，本研究首次發(fā)現(xiàn)了唾液中異發(fā)酵乳桿菌DSM 5705(band type 14)在根齲組唾液中的檢出率亦遠高于健康組。異發(fā)酵乳桿菌可以代謝葡萄糖等生成乳酸，且產(chǎn)酸能力較發(fā)酵乳桿菌更強[21]，其最適pH值范圍為4.1-6.9，但目前其與根齲發(fā)生的關(guān)系尚未見報道。除此之外，本試驗也證實了副流感嗜血桿菌T3T1(band type5)和奈瑟菌sp.11-26360(band type 32)與健康的口腔狀況關(guān)系密切[21,8,10]。由于唾液微生物菌群結(jié)構(gòu)的相對穩(wěn)定性及唾液取樣無創(chuàng)方便的優(yōu)勢，因此唾液微生物常常被作為口腔疾病檢測的分子生物學(xué)標記。本文發(fā)現(xiàn)有6個菌株在兩組人群中的分布存在明顯差異，或許可以為根齲的唾液檢測提供一定的理論依據(jù)。

根據(jù)聚類分析的結(jié)果，我們無法將根齲及健康老年人唾液微生物分成2個截然不同的群落，可能與本研究樣本量有關(guān)，或例外樣品的存在有關(guān)。由于宿主的選擇作用，唾液微生物群落本身就具有個體獨特性[22]。但是，本文發(fā)現(xiàn)健康老年人唾液微生物相似性(Dicer系數(shù)為0.61)高于根齲組，提示可能有穩(wěn)定的唾液微生物菌群存在，它們對于維持老年人口腔健康十分重要。因此老年人應(yīng)定期進行口腔檢查及口腔衛(wèi)生保健，維護良好的口腔生態(tài)平衡，保持口腔健康。