FTY720-P聯合同種異體骨移植修復兔橈骨大段骨缺損的實驗研究??

鄧子文，黃 東，蔡 慧，徐世明

(1.廣東醫科大學研究生學院，廣東湛江 524023；2.廣東省第二人民醫院創傷顯微外科，廣州 510317)

骨移植是臨床上最常見的移植類手術之一，全球每年有超過200萬患者進行骨移植手術，在美國選用同種異體骨作為骨移植材料占總骨移植數量的1/3[1-2]。但是，大段同種異體骨移植后因感染、再次骨折、骨不連等并發癥導致的遠期失敗率高達25%[3-4]。如何促進大段同種異體骨的骨誘導能力，降低移植后的并發癥成為研究熱點。FTY720是一種新型免疫抑制劑，在體內活性成分為FTY720-P，除能有效抑制免疫反應外，還具有一定的成骨作用，但機制尚不清楚[5-6]。本文擬通過動物實驗探索FTY720-P聯合同種異體骨修復骨缺損的效果，為該藥在臨床上的應用及后續研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 普通級成年新西蘭大白兔40只，雄性，體質量2～3 kg，由廣東省醫學動物實驗中心提供。

1.1.2主要儀器與試劑 FTY720-P(美國Cayman公司)，兔骨形態發生蛋白-2(BMP-2)多克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司)，電子萬能試驗機(上海企想檢測儀器有限公司)，BX43型顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1同種異體骨的制備 隨機選取4只新西蘭大白兔，采用耳緣靜脈注射空氣法處死，無菌條件下完整取出四肢長骨，用微型多功能電鋸將取下的長骨鋸成長約15 mm的骨段，1∶1甲醇和氯仿12 h脫脂，30%過氧化氫(H2O2)12 h脫蛋白，0.6 mmol/L HCl 5 min脫鈣[7]后獨立包裝，以25 kGy60Co輻照滅菌12 h，然后將同種異體骨放入-80 ℃深低溫冰箱中保存備用。

1.2.2同種異體骨移植 首先按說明書將FTY720-P配制成濃度為1 mg/mL的溶液備用。受試動物用戊巴比妥聯合846合劑麻醉，右前肢橈骨中段充分暴露，用微型多功能電鋸在橈骨中段建立15 mm長骨缺損模型,然后將動物隨機分為A、B、C 3組，每組12只。其中A組移植用1 mg/mL FTY720-P溶液浸泡30 min后的同種異體骨，B組移植未做處理的同種異體骨，C組移植自體橈骨。

1.2.3影像學檢查 術后4、8、12周各組隨機抽取6只動物經耳緣靜脈戊巴比妥麻醉后常規攝X線片，觀察骨移植區骨痂、新骨形成情況，并采用Lane-Sandhu法[8]進行影像學評分。

1.2.4組織學與免疫組織化學檢測 術后4、8、12周各組隨機抽取3只動物空氣法處死，完整取出右前肢橈骨，4%多聚甲醛固定24 h，乙二胺四乙酸(EDTA)法脫鈣1～3周，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，沿移植骨縱軸縱向行4 μm厚度組織切片，行蘇木精-伊紅(HE)染色及免疫組織化學染色。BMP-2抗體工作濃度1∶200，二氨基聯苯胺(DAB)方法顯色，棕色判為陽性，對照以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替Ⅰ抗。

1.2.5生物力學檢測 術后12周各組剩余的6只動物采用耳緣靜脈注射空氣法處死，然后完整取出右前肢橈骨進行三點彎曲試驗。實驗前先對標本移植區進行人工彎曲，若移植區不穩定或極易發生彎曲則判定為修復失敗，反之繼續行三點彎曲實驗。將標本放于儀器上，間距30 mm，在移植骨中點位置向下加載負荷，加載速度10 mm/min，記錄最大彎曲強度及位移。

2 結 果

2.1X線片觀察和Lane-Sandhu評分 骨移植后第4周，A組移植骨與宿主骨交界處近端觀察到骨痂形成；第8周，A組移植骨與宿主骨交界處近遠端均觀察到骨痂形成，且骨痂形成的量大于B組；第12周，A、C組移植骨與宿主骨間已完全融合，B組則尚未完全達到融合，見圖1。在骨移植后第4、8、12周A、C組Lane-Sandhu評分均高于B組，差異有統計學意義(P<0.05)；A、C組術后各時間點Lane-Sandhu評分比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2。

2.2組織學觀察 術后4周，A組橈骨斷端及移植骨周圍可見少量炎性細胞，大量骨痂形成，主要成分為纖維組織及軟骨細胞、局部見編織骨形成、伴有少量骨髓腔，纖維組織內可見較多破骨細胞及碎骨片(圖3A)；B組橈骨斷端周圍較多炎性細胞聚集及大量纖維組織增生，局部見少量軟骨細胞及少量編織骨(圖3D)；C組橈骨斷端及移植骨周圍見大量骨性骨痂，植入體內可見少量血管(圖3G)。術后8周，A組橈骨斷端見少量軟骨細胞及大量編織骨，移植骨內見少量血管生成，骨髓腔內形成骨小梁、可見少量骨髓(圖3B)；B組移植骨與周圍編織骨部分融合，融合部位植入體內可見極少量小血管(圖3E)；C組橈骨斷端形成大量板層骨，與移植骨融合，骨髓腔再通(圖3H)。術后12周，A組橈骨斷端可見大量板層骨生成，移植骨與新生的板層骨融合(圖3C)；B組移植骨與新生骨組織基本融合，周圍見少量板層骨(圖3F)；C組移植骨骨皮質重塑，但較正常骨皮質薄(圖3I)。

2.3BMP-2免疫組織化學染色 術后4周各組中BMP-2均可見陽性表達，主要表達于新生成骨質的骨陷窩、新生骨附近成骨細胞細胞質及纖維性骨痂基質內，見圖4。

圖1 3組骨移植后各時間點X線片

*：P<0.05，與B組比較圖2 3組術后各時間點Lane-sandhu評分(n=6)

A～C：A組術后4、8、12周；D～F：B組術后4、8、12周；G～I：C組術后4、8、12周圖3 3組術后各時間點組織學檢查(HE×40)

2.4生物力學檢測 人工彎曲實驗結果顯示A組、C組移植骨與宿主骨完全融合，B組部分標本移植骨與宿主骨界限仍較清晰。三點彎曲實驗顯示，A組修復后的橈骨最大彎曲強度大于B組(P<0.05)；與C組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖5。

*：P<0.05，與B組比較；intact：對側正常橈骨圖5 三點彎曲實驗測試術后12周3組骨移植修復骨缺損后橈骨的最大彎曲強度

3 討 論

大段同種異體骨常用于嚴重創傷、骨腫瘤切除后的保肢治療，但大段同種異體骨移植后移植區域周圍血供不足及遠期并發癥如移植骨與宿主骨骨不連(10%～30%)、持續感染(6%～13%)、二次骨折(10%～30%)[9-11]等的發生卻令臨床醫生不盡滿意，往往導致患者功能差，甚至手術失敗。許多學者通過在同種異體骨上復合自體干細胞[12]、重組蛋白[13]、富血小板血漿[14]、基因治療[15]等方法來促進大段同種異體骨移植周圍微血管網的再生及異體骨與宿主骨的融合，取得一定效果。近期研究發現，局部應用1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)結構類似物FTY720可促進同種異體骨移植后移植骨與宿主骨之間的融合。

S1P是一類真核生物體內天然存在的具有生物活性的細胞膜鞘類脂質的代謝中間產物[16]，由鞘氨醇在鞘氨醇激酶(sphingosine kinase，SPHK)的磷酸化作用下形成，通過與S1P受體(sphingosine-1-phosphate receptor，S1PRs)結合調控多種細胞的增殖、分化、遷移、凋亡、定位[17]。鞘氨醇結構類似物FTY720是一種新型免疫抑制劑，體內經SPHK2磷酸化為活性成分FTY720-P，可非選擇性結合S1PRs從而發揮生物效應[18-19]。現有研究表明，FTY720/FTY720-P可趨化破骨細胞由骨表面向外周血遷移，抑制破骨細胞的形成[20-21]。同時，在切除卵巢的小鼠中，FTY720可促進其骨髓源間充質干細胞向成骨細胞分化，FTY720顯著增加成骨細胞分化標志物堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(OCN)、Runx2及Sp7的表達[22]。分子細胞的研究說明，FTY720/FTY720-P對骨代謝有著重要的影響。本研究在利用FTY720-P聯合同種異體骨修復兔橈骨大段骨缺損的動物實驗中觀察到，術后12周運用FTY720-P的A組成功修復橈骨大段骨缺損，三點彎曲實驗中A組修復后的橈骨生物力學強度明顯大于單純同種異體骨修復后的橈骨。術后4、8、12周A組骨痂形成的量、Lane-Sandhu評分均明顯高于單純同種異體骨修復的橈骨，可達到類似自體骨的修復效果。說明FTY720-P可促進同種異體骨與宿主骨的融合，增強其生物力學強度。

研究發現，通過連續皮下注射FTY720并不能促進鼠股骨骨折的愈合及骨缺損的修復[23]。但將FTY720以聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLAGA)為支架復合在同種異體骨上修復鼠顱骨、脛骨骨缺損的實驗中，發現FTY720可明顯促進骨形成[24-26]。復合在同種異體骨上的FTY720隨著PLAGA的降解持續在骨缺損周圍釋放，使得局部FTY720的濃度維持在一定范圍，可促進骨缺損周圍微血管網的形成及小動脈的擴張，增加骨缺損區域血供，促進骨缺損的修復[24-26]。本研究將FTY720-P通過浸泡的方法復合在同種異體骨上，增加異體骨局部FTY720-P濃度，在術后8周A組HE染色結果觀察到異體骨內新生血管形成，B組僅見極少量血管。說明經FTY720-P浸泡后的同種異體骨移植后對其局部血管形成同樣有一定促進作用，進而促進異體骨與宿主骨的融合。

同種異體骨移植后的免疫排斥反應同樣影響其與宿主骨間的融合。而FTY720作為一種免疫抑制劑，可抑制淋巴細胞從淋巴結釋放入外周血，并在臨床上已應用于治療多發性硬化癥[18-19]。骨折愈合早期特征是免疫細胞侵入局部血腫的炎性反應階段[27]。同種異體骨局部釋放FTY720可明顯減少移植區CD45+白細胞數量[25]。本實驗中觀察到術后4周B組移植骨周圍見較多炎性細胞，而A組炎性細胞少見，表明FTY720-P對局部炎性反應有抑制作用，筆者推測這一作用可能是FTY720-P促進異體骨與宿主骨融合的機制之一。

綜上所述，移植經FTY720-P浸泡后的同種異體骨可促進異體骨局部血管形成、降低局部炎性反應，增強異體骨生物力學強度，成功修復大段骨缺損，可達到自體骨修復骨缺損的效果，為臨床降低大段同種異體骨移植后遠期并發癥的發生提供一種新的治療決策。但浸泡后FTY720-P的復合效率及作用時間的確定還需進一步研究。