血管內皮生長因子對兔腹主動脈支架植入后血管內皮功能的影響研究??

苗建波，安少波，徐 雷，張曉蕾，胡喜田，吳志紅，都 偉

(石家莊市第一醫院心血管內科 050011)

冠狀動脈介入術的發展與廣泛應用顯著改善了冠心病患者總體預后與生活質量，但術后發生的支架內血栓(stent thrombosis，ST)形成仍是困擾臨床的重要難題[1]。藥物涂層支架的應用使支架內再狹窄發生率明顯降低，而ST形成并未明顯減少。目前，臨床認為ST形成的主要機制在于藥物涂層支架導致血管再內皮化延遲。因此，加快血管內皮化有利于恢復血管功能，預防ST形成。既往觀點認為，受損血管邊緣內皮細胞遷移、增生是完成血管再內皮化的主要途徑[2]。而現代醫學顯示，起源于骨髓的干細胞或內皮祖細胞(endothelial progenitor cell，EPC)經血管損傷激活后，遷移至損傷血管區域，參與血管再內皮化[3]。有研究表明，粒細胞集落刺激因子能夠激活EPC，促進血管再內皮化，但其促炎作用較強，在安全性方面欠缺[4]。血管內皮生長因子(VEGF)亦可通過刺激骨髓作用，激活EPC，從而促進血管再內皮化，防止術后ST形成，同時VEGF促炎作用較弱，安全性較高。本研究通過設計隨機對照實驗，觀察VEGF對新西蘭兔腹主動脈支架植入后血管內皮再生速率及血管內皮功能的恢復，旨在為減少支架植入術后ST形成等并發癥的發生提供新的靶點與理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 健康新西蘭白兔35只，雄性，年齡4～6個月，體質量2.5～3.0 kg，購自四川動物養殖中心。

1.1.2實驗儀器與試劑 苦味酸固定液：將1.2 g苦味酸加至100 mL蒸餾水內，使溶液形成飽和狀態；改良蘇木精染液：蘇木精0.25 g、硫酸鋁鉀0.5 g、碘酸鈉25 mg、冰醋酸1 mL、甘油15 mL、無水乙醇2 mL、蒸餾水33 mL；1%鹽酸-乙醇分化液：45.5 mL 70%乙醇、0.5 mL濃酸鹽；促藍液：硫酸鎂與碳酸氫銨分別2.00、0.35 g，蒸餾水100 mL。恒溫箱、二氧化碳(CO2)培養箱、酶標儀、光學顯微鏡、天平等。

1.1.3實驗飼料 高脂飼料，含15%蛋黃粉、0.5%膽固醇、5%豬油、79.5%普通飼料。

1.2 方法

1.2.1建立高脂血癥動物模型 分籠飼養新西蘭兔，觀察7 d后，抽取兔靜脈血，檢測總膽固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白等各項血脂指標，完成各項測定后，開始喂養高脂飼料，持續喂養3周，剔除高脂飼料中膽固醇，繼續喂養至6周后，復查血脂水平。

1.2.2組織形態學分析 處死新西蘭兔5只，取其腹主動脈切片觀察脂質沉積與動脈硬化程度。將腹主動脈置于苦味酸飽和溶液中固定，采用乙醇脫水，二甲苯透明、石蠟包埋，制作石蠟塊，連續切片，行蘇木精-伊紅(HE)染色，經光學顯微鏡觀察動脈粥樣硬化斑塊。

1.2.3實驗動物分組 采用隨機數字表法將余下30只新西蘭兔分為兩組：裸金屬支架組、裸金屬支架+VEGF組，各15只。

1.2.4支架植入 兩組實驗動物均植入裸金屬支架，在動物導管室進行所有操作，確保無菌操作流程。術前3 d開始喂服阿司匹林(山西新寶源制藥有限公司，批號:國藥準字H14020945)，25 mg/d；氯吡格雷(深圳信立泰藥業股份有限公司，批號:國藥準字H20000542)，75 mg/d。經兔耳緣靜脈注射3%戊巴比妥(上海新亞藥業有限公司，批號:國藥準字H31021725)1 mL/kg，麻醉完成后，將兔固定于操作臺上，將其腿部毛褪去。應用聚維酮碘與75%乙醇脫碘消毒腿部皮膚，于消毒區域鋪巾，鋪巾范圍小于消毒區域，作為手術視野。抽取2 mL利多卡因(紫光古漢集團衡陽制藥有限公司，批號:國藥準字H43021924)，局部浸潤麻醉。將兔腿部皮膚切開，逐層分離，顯露右股動脈，行穿刺針穿刺，見回血噴射后，置入導引鋼絲，并于腹主動脈內送入6 F引導管。經引導管予以100 U/kg肝素鈉，透視條件下，鋼絲進入腹主動脈，注意避開腎動脈分叉，沿鋼絲進入造影導管，做腹主動脈造影，測量血管直徑，確定目標血管，造影結束后將造影導管撤出。采用3.5 mm直徑的球囊攜帶支架植入腹主動脈，球囊支架與血管直徑比為1.1～1.2∶1.0。將球囊充盈至8 atm，維持10 s，待支架與血管壁完全貼合后，將球囊撤出，造影觀察血管，血管通暢，無影像學異常后，將造影管與鞘管退出，嚴格止血、逐層縫合傷口，用碘酒消毒皮膚。兔清醒后，送至籠內繼續飼養。術后常規肌內注射800 kU青霉素(天津華津制藥有限公司，批號:國藥準字H12021258)，2次/天，共注射3 d。

1.2.5應用VEGF 裸金屬支架+VEGF組植入支架后，即刻經導管予以40 μg VEGF121，隨后于術后第2～9、16～23、31～38天，經皮下應用VEGF121，1 μg/d。裸金屬支架組注射等劑量與頻率的生理鹽水。

1.2.6檢測外周血EPC 所有實驗動物手術前均經耳緣靜脈取2 mL靜脈血，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，采用密度梯度離心法將單個核細胞分離，收集細胞1×106個重懸于100 μL磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中，加至流式管內，同時加入異硫氰酸熒光素(FITC)標記的CD34與藻紅蛋白(PE)標記的CD45各20 μL，用于同型對照。另一流式管內，加抗凝血100 μL、FITC標記的IgG120 μL、PE標記的IgG120 μL。4 ℃下避光孵育，洗滌，根據說明書要求上機，流式檢測外周血中CD34+/CD45+的EPC百分率，計數EPC。

1.2.7檢測血管再內皮化速率 分別于術后15、30、60 d，由各組中隨機選出新西蘭兔5只，將其處死。取支架覆蓋段腹主動脈，包括相鄰上下血管段5 mm，橫向剪開支架植入段血管，平均分為兩段，其中一段以4%多聚甲醛固定，行脫水、透明、石蠟包埋處理，隨后進行HE染色，對內膜增生程度進行觀察；另一段采用2%戊二醛溶液浸泡、固定，應用梯度乙醇脫水，經臨界點干燥與鍍膜，在電鏡下掃描觀察血管內皮化程度，測算內皮覆蓋率。

1.3觀察指標 比較兩組術后1、7、14、28 d EPC數量與術后15、30、60 d損傷血管再內皮化速率。

2 結 果

2.1EPC數量比較 兩組術后13 d，均出現2只新西蘭兔死亡，15 d時處死5只用于檢測血管再內皮化速率。裸金屬支架+VEGF組各時段EPC數量均明顯高于裸金屬支架組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

2.2損傷血管再內皮化速率 15 d后，兩組均出現明顯的血管再內皮化，其中裸金屬支架+VEGF組基本完成內皮化；30 d后，兩組內皮化完成，但裸金屬支架組細胞形態仍與正常內皮存在較大差異，裸金屬支架+VEGF組細胞變長，已接近于正常內皮層形態；60 d后，裸金屬支架表面完全覆蓋，但存在纖維狀結構。裸金屬支架+VEGF組血管內支架表面未出現變化，提示支架植入30 d后內膜損傷過程在已完成，見圖1～3。

表1 兩組EPC數量比較

A：裸金屬支架組；B：裸金屬支架+VEGF組圖1 術后15 d兩組損傷血管再內皮化程度(×50)

A：裸金屬支架組；B：裸金屬支架+VEGF組圖2 術后30 d兩組損傷血管再內皮化程度(×50)

A：裸金屬支架組；B：裸金屬支架+VEGF組圖3 術后60 d兩組損傷血管再內皮化程度(×50)

3 討 論

EPC在冠狀動脈支架植入引起的血管損傷修復中的作用報道較少，既往有報道患者行冠狀動脈血管成形術后，內皮細胞數量在外周循環中明顯增多，內皮細胞集落形成在24 h內增加2～3倍[5]。另外，單純行冠狀動脈造影而未實施冠狀動脈支架植入術患者內皮細胞集落形成單位無明顯變化，提示內皮細胞集落形成與血管損傷具有一定關系[5]。以往動物實驗中發現，洛伐他汀與辛伐他汀能夠激活血管損傷后EPC，促進再內皮化，緩解內膜增生，但有研究提出，僅有特殊的干細胞可促進再內皮化[6]。同時多數研究表明，粒細胞集落刺激因子能夠激活EPC，提高再內皮化速率，抑制內膜增生，但研究的缺陷在于動物模型血管損傷僅由介入導管所致，尚未植入支架，故無法顯示支架植入后再內皮化程度[7]。而在以狗為實驗對象的研究中，主動脈移植術后應用粒細胞集落刺激因子在促進再內皮化的同時，內膜增生十分明顯，加之粒細胞集落刺激因子促炎作用顯著，其臨床應用安全性受到普遍質疑[8]。

本研究選取新西蘭兔腹主動脈支架植入模型作為觀察對象，結果發現，裸金屬支架+VEGF組術后EPC數量明顯多于裸金屬支架組，且損傷血管再內皮化速率明顯大于裸金屬支架組，提示VEGF在支架植入術后有助于促進EPC活化，加快損傷血管再內皮化速率，從而改善血流動力學。VEGF主要分泌于血管內皮細胞，是內皮細胞生長與分化不可缺少的因子，其不僅參與胚胎血管形成，在修復血管生理性損傷、促進病理性血管新生中同樣扮演著重要角色[9-11]。冠狀動脈支架植入術是治療冠心病的主要手段，能夠有效開通狹窄或閉塞動脈，但該術式面臨的問題是支架植入后，粥樣硬化斑塊受壓縮而破裂，造成血管內皮損傷，基底膜顯露，進而引起血小板聚集，誘發血栓形成[12]。另外，血管內皮損傷可增加多種細胞因子的分泌，導致血管平滑肌細胞過度增殖，造成術后支架內再狹窄。因此，及時修復血管內皮損傷對預防冠狀動脈支架植入術后支架內再狹窄十分關鍵[13]。由于冠狀動脈支架植入術損傷血管內皮細胞，導致EPC快速增殖、遷移，其中EPC主要見于骨髓，是多能細胞的一種，在人胚胎血管生成、出生后血管新生及內皮損傷修復等過程中均有參與，當機體出現損傷信號時，EPC在損傷信號的誘導下遷移至損傷局部，并逐漸分化為成熟的血管內皮細胞，促進血管新生與修復[14-15]。VEGF由成熟血管內皮細胞經旁分泌機制分泌，而VEGF亦可通過促進EPC增殖分化，加速內皮生長與修復。VEGF促內皮細胞分裂、增殖的特點如下：(1)VEGF能夠通過肝素結合位點與硫酸肝素結合，達到延長自身作用時間的效果；(2)血管內皮細胞與VEGF二者間可形成正反饋效應，進而增強VEGF作用[16]；(3)VEGF可通過阻止腫瘤壞死因子α等因子的產生，抑制自身凋亡，從而延長作用時間，實現高效的修復內皮細胞功能。故高水平VEGF可顯著加快再內皮化過程，促進內皮細胞屏障功能的恢復，預防血栓形成[17]；此外，VEGF可對抗超氧化物等多種有害物質，抑制內皮細胞過度增生，避免或減少術后再狹窄形成。

綜上所述，裸金屬支架聯合VEGF可明顯增加EPC水平，促進損傷血管再內皮化，有利于局部組織血流灌注，減輕機體組織損傷。