晚期氧化蛋白產物通過內質網應激調節人腎小管上皮細胞自噬的研究??

李敏暉，湯 珣，姜婷婷，張雯英，謝 唯，章 俊△

(1.南方醫科大學南海醫院血液凈化中心，廣東佛山 528244；2.南方醫科大學珠江醫院腎內科，廣州 510280)

晚期氧化蛋白產物(advanced oxidation protein products，AOPPs)是一類尿毒癥毒素，近年來，大量證據表明其與腎臟疾病的發生、發展密切相關[1]。內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是細胞損傷的早期應激事件。本課題組在新近的研究中發現，AOPPs可誘導腎小管上皮細胞(HK-2細胞)發生ERS[2]。但AOPPs是否可導致HK-2細胞出現代謝活性降低等其他損傷改變尚未十分明確。自噬是普遍存在于真核細胞中的一種溶酶體依賴的降解途徑[3]。本課題組前期研究表明AOPPs能抑制HK-2細胞的自噬活性，而其具體機制仍有待闡述[4]。ERS和自噬之間的直接聯系在近年被相繼報道。但是AOPPs誘導的ERS與自噬活性降低之間是否存在聯系及其具體關聯機制尚不清楚。本文主要探討AOPPs誘導的ERS是否介導了自噬活性降低的過程及其機制，旨在進一步闡明HK-2細胞在應對外界應激時內環境與代謝活性改變的機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料 HK-2細胞株[(美國模式培養物集存庫(ATCC)]；無內毒素牛血清清蛋白(BSA，美國Sigma公司)；次氯酸(美國Gibco公司)；ERS激活劑Thapsigargin(美國Sigma公司)、ERS抑制劑Salubrinal及腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)抑制劑Compoun C(美國MedChem Express公司)、AMPK激活劑AICAR(美國Selleck公司)；磷酸化AMPK(p-AMPK)、AMPK、乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化mTOR(p-mTOR)、Beclin1、p62、LC3、CHOP兔抗人一抗(美國Cell Signaling Technology公司)，葡萄糖調節蛋白78(GRP78)兔抗人一抗(中國Proteintech公司)；電化學發光(ECL)檢測試劑盒(美國Millipore公司)。

1.2 方法

1.2.1體外制備AOPPs 將不含游離氨基酸、碳水化合物、脂類成分的BSA與200 mmol/L次氯酸按1∶140混合，室溫避光慢搖30 min，在磷酸鹽緩沖液(PBS)中4 ℃透析24 h以除去游離的次氯酸，并用Detoxi-Gel柱去除內毒素。通過測定340 nm處的吸光度值估算AOPPs含量，以氯胺T為標準取得，內毒素含量低于0.025 EU/mL。

1.2.2HK-2細胞的培養 將HK-2細胞培養于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培養基中，胰酶消化后接種于培養皿或6孔板，待細胞貼壁12 h后換為含2% FBS的DMEM/F12培養基使細胞同步生長。

1.2.3實驗分組 (1)為明確AOPPs對HK-2細胞AMPK/mTOR信號通路的影響，將細胞分為3組：①正常組；②BSA組：200 μg/mL BSA作用48 h；③AOPPs組：200 μg/mL AOPPs作用48 h。(2)為明確AMPK/mTOR信號通路在AOPPs影響自噬活性中的作用，將細胞分為5組：①正常組；②BSA組：200 μg/mL BSA作用48 h；③AOPPs組：200 μg/mL AOPPs作用48 h；④Compoun C(AMPK阻斷劑)組：1 mmol/L Compoun C處理細胞48 h；⑤AICAR(AMPK激活劑)組：AICAR 5 mmol/L預處理1 h后，給予200 μg/mL AOPPs作用48 h。(3)為明確ERS介導AOPPs對細胞自噬水平的影響及其機制，將細胞分為5組：①正常組；②BSA組：200 μg/mL BSA作用48 h；③AOPPs組：200 μg/mL AOPPs作用48 h；④Thapsigargin(ERS激活劑)組(Tag組)：0.25 μmol/L Thapsigargin處理細胞48 h；⑤Salubrinal(ERS阻斷劑)組(Sal組)：50 μmol/L Salubrinal預處理1 h后，給予200 μg/mL AOPPs作用48 h。

1.2.4蛋白質印跡法(Western blot) 細胞培養及干預方法同1.2.3，作用48 h后，RIPA裂解細胞后提取細胞總蛋白，隨后采用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。用5%脫脂奶粉或BSA封閉1 h后，在一抗中4 ℃孵育過夜。吸棄一抗，TBST洗膜，每次10 min，共3次，然后在二抗中室溫孵育1 h。TBST洗膜，每次10 min，共3次，隨后室溫下ECL顯色。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內參。

2 結 果

2.1AOPPs對AMPK/mTOR信號通路的影響 根據前期研究，將未經修飾的BSA(200 μg/mL)和AOPPs(200 μg/mL)分別刺激HK-2細胞48 h。Western blot結果顯示，與正常組及BSA組相比，AOPPs可抑制AMPK的磷酸化和誘導mTOR的磷酸化，激活AMPK/mTOR信號通路(P<0.05)，見圖1。

A：p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR蛋白Western blot條帶；B：p-AMPK與AMPK蛋白表達分析圖；C：p-mTOR與mTOR蛋白表達分析圖；*：P<0.05，與正常組比較;1：正常組；2：BSA組；3：AOPPs組圖1 AOPPs激活HK-2細胞的AMPK/mTOR信號通路

2.2AMPK/mTOR信號通路在AOPPs對HK-2細胞自噬活性影響中的作用 分別加入AMPK的特異性阻斷劑Compoun C和激活劑AICAR處理HK-2細胞，用Western blot檢測自噬標志物LC3、Beclin1和p62，以及AMPK、mTOR的磷酸化水平。結果顯示：Compoun C單獨處理細胞后，表現出與AOPPs相似的效應，表現為LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉換減少，Beclin1表達下降，p62表達上升，同時抑制AMPK的磷酸化，增加mTOR的磷酸化；而AMPK激活劑AICAR與AOPPs共同作用于HK-2細胞后，可部分逆轉AOPPs的作用，表現為激活AOPPs抑制的AMPK的磷酸化及抑制AOPPs誘導的mTOR的磷酸化，同時能使自噬活性升高，即LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉換增加，Beclin1上調，而p62表達下降(P<0.05)，見圖2、3。

圖2 自噬標志物蛋白Western blot條帶

A：LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、p62蛋白表達分析圖；B：p-AMPK與AMPK蛋白表達分析圖；C：p-mTOR與mTOR蛋白表達分析圖；*：P<0.05，與正常組比較；#：P<0.05，與AOPPs組比較;1：正常組；2：BSA組；3：AOPPs組；4：Compoun C組；5:AICAR組圖3 AMPK/mTOR信號通路介導AOPPs抑制HK-2細胞的自噬活性

2.3ERS對AMPK/mTOR信號通路的影響 為了明確ERS在AOPPs調節AMPK/mTOR信號通路中的作用，本研究予ERS激動劑Thapsigargin及抑制劑Salubrinal分別處理HK-2細胞48 h，檢測ERS激活的標志性蛋白GRP78、p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR的蛋白表達水平。Western blot結果顯示，加入Salubrinal后，AOPPs抑制AMPK的磷酸化和誘導mTOR的磷酸化效應可被部分逆轉，表現為AMPK磷酸化增加，mTOR磷酸化降低，而Thapsigargin能抑制AMPK的磷酸化，同時誘導mTOR的磷酸化，激活AMPK/mTOR信號通路，與AOPPs作用相似(P<0.05)，見圖4、5。

圖4 ERS激活的標志性蛋白Western blot條帶

A：GRP78蛋白表達分析圖；B：p-AMPK與AMPK蛋白表達分析圖；C：p-mTOR與mTOR蛋白表達分析圖；*：P<0.05，與正常組比較；#：P<0.05，與AOPPs組比較；1：正常組；2：BSA組；3：AOPPs組;4：Tag組；5：Sal組圖5 ERS參與AOPPs激活HK-2細胞AMPK/mTOR信號通路的過程

2.4ERS、AMPK/mTOR信號通路與自噬活性的關系 分別采用ERS抑制劑Salubrinal和激活劑Thapsigargin處理HK-2細胞，檢測自噬標志物的蛋白水平。結果顯示：加入ERS激活劑后，LC3Ⅱ及Beclin1降低，p62升高，即自噬活性降低。而AOPPs與ERS抑制劑共同作用于細胞后，AOPPs抑制的自噬被部分逆轉，表現為LC3Ⅱ和Beclin1升高，p62降低，即自噬水平上升(P<0.05)，見圖6。

A：LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、p62蛋白Western blot條帶；LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、p62蛋白表達分析圖；*：P<0.05，與正常組比較；#：P<0.05，與AOPPs組比較；1：正常組；2：BSA組；3：AOPPs組;4：Tag組；5：Sall組圖6 ERS通過激活AMPK/mTOR信號通路介導AOPPs誘導的自噬抑制

3 討 論

腎臟纖維化是慢性腎臟病(CKD)進展至終末期腎臟病的共同通路，近年來研究表明，腎小管間質病變程度與腎功能關系較腎小球病變更為密切[5]。大量研究表明，自噬與多種腎臟疾病的發生、發展有著密切的關系，如足細胞病[6]、糖尿病腎病[7]、急性腎缺血-再灌注損傷[8]等。有研究表明，糖尿病腎病中腎小管上皮細胞自噬活性降低[9]，而自噬活性上調可抵抗多種物質對腎小管上皮細胞的損傷作用，如尿蛋白[10]和糖基化終產物(AGEs)[11]等。本課題組前期研究發現AOPPs可降低HK-2細胞的自噬活性[4]，但是其誘導機制尚未明確。

近年來，大量證據表明AOPPs與腎臟疾病的發生、發展密切相關[1]。本課題組前期已經證明了AOPPs可通過調節p38 MAPK信號通路抑制HK-2細胞的自噬活性[4]。在此，本研究證明了AMPK/mTOR信號途徑可能參與了AOPPs誘導腎小管上皮細胞發生自噬抑制的過程。主要依據如下：(1)本實驗顯示，AOPPs可抑制AMPK的磷酸化和誘導mTOR的磷酸化，提示AOPPs可激活AMPK/mTOR信號通路。(2)AOPPs和AMPK蛋白抑制劑Compoun C均能抑制HK-2細胞的自噬活性，而AMPK激活劑AICAR能增加HK-2細胞的自噬活性。既往研究表明，AGEs能抑制HK-2細胞的自噬活性[11]，本課題組前期研究也表明，與AGEs同屬代謝產物的AOPPs也能抑制HK-2細胞的自噬活性[4]，本研究更是首次提出了AMPK/mTOR信號通路的激活介導了AOPPs誘導腎小管上皮細胞自噬活性降低的過程。

在氧化應激的病理條件下，AMPK激活能增加ATP生成并減少ATP消耗，維持機體能量平衡[12]，而氧化應激與ERS又密切相關[13]。故本研究繼續探討在AOPPs誘導HK-2細胞發生自噬活性抑制的過程中，AMPK/mTOR信號通路與ERS在其中的關系。本研究結果提示，在AOPPs抑制HK-2細胞的自噬活性過程中，AMPK/mTOR信號通路與ERS密切相關。主要依據如下：(1)ERS能調節AMPK/mTOR信號通路的蛋白活性。結果顯示，加入ERS激活劑Thapsigargin之后， AMPK/mTOR信號通路激活，相反，ERS抑制劑Salubrinal增加AMPK的磷酸化和抑制mTOR的磷酸化，提示ERS能激活AMPK/mTOR信號通路。(2)加入Thapsigargin之后，HK-2細胞的自噬活性受到抑制，而加入Salubrinal之后AOPPs的效應部分被逆轉，表現為自噬水平有所上升。結合前述AMPK/mTOR介導了AOPPs引發的自噬抑制，可以推測ERS可能通過激活AMPK/mTOR信號通路來誘導AOPPs對HK-2細胞自噬活性的抑制作用。此前，大量研究均提示ERS的發生能誘發自噬水平的上調[14]，而在本研究中，ERS的存在對自噬水平的調控發揮了抑制作用，這可能與ERS與自噬所處的環境及作用的時間差異有關。在細胞受到外界刺激的初始階段，ERS的發生與自噬水平的上調都是對細胞具有應對外界刺激的保護及適應作用，有助于恢復內環境的穩態，而持續存在的ERS會產生警戒信號，最終使內質網損傷變為不可逆，此時可能抑制自噬水平，對細胞造成級聯式的損傷。

綜上所述，本研究首次提出ERS通過激活AMPK/mTOR信號通路參與了AOPPs誘導HK-2細胞自噬活性的抑制過程。本研究提出了HK-2細胞自噬活性調節的新機制，抑制或阻斷ERS及AMPK/mTOR信號通路，對增加腎小管上皮細胞自噬活性、防治腎間質纖維化具有重要意義，為研究腎間質纖維化提供了新的方向。