3-羥基丁酸-3-羥基己酸共聚酯材料促進小鼠胚胎干細胞分化為心肌細胞的實驗研究

李海洋 許士俊 張宏家

心肌梗死是臨床上常見且嚴重的疾病，心肌細胞壞死后無法再生。干細胞移植能夠通過分化成損傷部位的細胞從而達到治療疾病或者改善預后的目的。但是，由于細胞移植后沒有適宜的載體，細胞流失、壞死嚴重，治療效果下降。因此，尋找一種能夠模擬細胞生長環境并且可以促進細胞生長、增殖和分化的載體至關重要[1]。胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)能夠分化成所有三胚層細胞[2]，具有廣泛的全能性，被大量應用在臨床醫學、再生醫學領域。聚羥基脂肪酸脂(PHA)，3-羥基丁酸-3-羥基己酸共聚酯(PHBHHx)由微生物合成[3]在體內能夠自我降解，具有良好生物相容性，前期研究表明由PHBHHx制成的細胞補片不僅能與骨髓間充質干細胞相互融合，而且能夠促進骨髓間充質干細胞向軟骨細胞分化[4]，本文通過將mESC接種到PHBHHx膜上，探討此生物材料對mESC增殖和分化的影響，為mESC進一步應用于臨床治療心肌梗死奠定實驗基礎。

材料與方法

1.材料 (1)干細胞：小鼠胚胎干細胞(mESCs)來R1干細胞系。(2)主要試劑：高糖DMEM(Gibco)、5%血清替代品(SR，Gibco)、L-谷氨酰胺(Gibco)、青鏈霉素(Gibco)、絲裂霉素C(Sigma)、1%的非必需氨基酸(Gibco)、0.1mmol/Lβ- 巰基乙醇(Gibco)、基質膠(BD Pharmingen)磷酸鹽緩沖液(PBS，Gibco)、明膠、0.05% 胰酶(Gibco)。(3)主要儀器 CO2培養箱(Thermo，HERA cell 150i)、低速控溫離心機(Thermo Scientific CL10)、6孔板/24孔板/96孔板細胞培養皿(NUNC)、高速控溫離心機(Thermo)、凍存管(NUNC)、6 cm/10 cm 細胞培養皿(NUNC)、液氮罐(Thermofisher)、電動移液器(Thermo Scientifi c FinnpipetteC1)、50 mL/15 mL 離心管(NUNC)、低粘附性培養皿、超凈臺、顯微鏡、水浴鍋。

2.實驗方法 (1)制備誘導多能干細胞的滋養層細胞 將懷孕13 d左右的昆明白鼠通過拉頸處死，無菌條件下，用彎鑷將子宮摘除，用PBS將血漬洗去。用剪刀將子宮和胎膜剪開，把胚胎取出，然后把胚胎的頭部和內臟剪除，經過PBS充分洗滌，把組織剪成碎塊(體積在1 mm3以下)，經過濾網，濾除大塊的組織塊，留取濾過液，然后放置在離心管中，大約安放5～10min，待分層后，把上清液去除，把含0.25%胰酶+0.04%EDTA溶液加到離心管中，約1mL，輕柔地吹吸，大約消化2min，之后終止消化(把等體積的MEF培養液加到離心管中)，隨后離心，800r，5min左右，留取沉淀。將細胞重懸于滋養層上，密度大約為5×105/mL,在5%CO2，37℃的細胞培養箱中培養，當細胞長至90%的融合度后進行傳代，將細胞傳代三次后，將10μg/mL的絲裂霉素C加入培養液中，繼續培養2.5h，然后將細胞培養液吸除，加入PBS，洗去殘存的死細胞和細胞培養液，加入適量的胰酶將細胞進行消化，離心4min，轉速800，將離心后的細胞重新懸浮于細胞培養基中，接種到經過明膠處理的100mm培養皿中，密度約為5×104/mL。

(2)小鼠胚胎干細胞的培養 將凍存在液氮中的小鼠胚胎干細胞取出，迅速解凍，放到離心管中進行離心，速度800r，時間4min，把凍存液吸出，丟棄，加入2mL干細胞培養基重懸細胞，然后把細胞接種于已經處理好的細胞飼養層上，放入細胞培養箱中進行培養，3d換1次細胞培養基。等到細胞長至較密或者細胞團塊過大后，加入胰酶進行消化傳代，應用差速貼壁法將MEF去除，然后接種到沒有飼養層的培養皿中繼續進行培養。干細胞培養液(1%的青鏈霉素、1 000 U/mL LIF、10%的干細胞胎牛血清、高糖DMEM、1%的非必需氨基酸、1%L-谷氨酰胺、0.1%的β-巰基乙醇)

(3)共培養及染色 把聚羥基脂肪酸脂膜剪成圓片狀，直徑約0.5cm，然后對其進行消毒滅菌，首先放入75%乙醇中浸泡2h，緊接著，放到超凈臺中用紫外線照射約2h，隨后在保持膜表面平整的情況下，貼到96孔板中，加入培養基，浸泡過夜。然后將mESC接種到板中，保持細胞濃度1×104個/mL，與細胞補片共培養，每孔加入干細胞培養基200μL。在細胞培養3d后，固定細胞后制作電鏡標本并進行DAPI染色觀察細胞生長情況。

(4)向心肌細胞分化 實驗分為實驗組和對照組，用96孔板培養細胞，每組再細分為四個小組，八個孔為一個小組，編號為組一，二，三，四，組一用PHBHHx膜培養細胞，組二為傳統培養皿，組三鋪PHBHHx膜，組四為傳統培養皿，組一和組二加入含維生素C(0.1mg/L)的分化培養基[5](去除LIF),組三個組四用不添加任何誘導劑的分化培養基培養，每個孔細胞數大約2 000個，細胞培養基200nL，放入培養箱中培養，每天觀察細胞分化情況。

(5)心肌細胞的鑒定 加入分化培養基培養15d后，觀察細胞形態，發現細胞呈梭形，類似心肌細胞，對細胞進行免疫熒光染色，鑒定心肌特異性標志蛋白cTnT的表達情況。將培養基用吸管吸除，加入PBS清洗3遍以上，加入4%的多聚甲醛，常溫固定20min，吸除多聚甲醛后，再加入PBS清洗，不少于3次，每次不少于5min。然后對細胞進行打孔(加入0.1% tritonX-100)，約10min。將上清液吸棄后，加入PBS清洗如上所述，之后加入5%的BSA(牛血清蛋白)，對細胞進行封閉，時間約30min，之后吸棄上清，PBS充分洗滌，加入一抗兔抗鼠心肌肌鈣蛋白T，4度過夜，PBS充分清洗后，加入山羊抗兔熒光二抗，避光，孵育45min后，PBS充分洗滌，加入DAPI染色劑，染色30min(避光)，PBS充分洗滌后，加入封片劑，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

圖1 MEF生長情況 A：第一代MEF；B：第2代MEF；C：第3代MEF

圖2 mESC在PHBHHx膜上粘附生長；圖3 PHBHHx膜培養細胞增殖明顯比傳統的培養皿培養要快

(6)心肌細胞標志蛋白cTnT的表達量 小鼠胚胎干細胞誘導分化15天后，吸除培養基，PBS充分洗滌后加入胰酶消化細胞2min，加入培養基終止消化，離心后，吸除上清液，收集細胞，離心5min(1 700r/min)，扣干，加入細胞打孔劑(0.1% tritonX-100),10min后，加入PBS充分洗滌，離心后棄掉上清液，然后加入BSA封閉細胞30min，離心后，吸除上清液，加入一抗，4°過夜后，加入二抗，避光孵育后上機檢測。

3.統計學分析 采用SPSS20.0統計學軟件進行統計處理。計量資料以均數±標準差表示，計量資料間兩組均數比較采用t檢驗。多組間差異采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblast，MEF)的生長情況 MEF呈貼壁生長，有較大的異質性，大小差別較大，胞質可向外伸出偽足，形成多種形狀，如多邊形、梭形，啞鈴型及不規則的形狀，細胞核位于中間，形狀類卵圓形。第一代培養的小鼠成纖維細胞含有較多的雜細胞，導致細胞不純，從而可能影響細胞的活力。通過細胞傳代，發現第3代細胞比較純，細胞活力較強，所以選擇其作為飼養層細胞。如圖1。

2.mESC與PHBHHx膜共培養DAPI染色 mESC生長迅速，一般培養三天就可以傳代，傳代之后細胞生長的更加迅速。當成團的細胞長大后，加入消化酶將細胞消化成單細胞，然后加入培養基重懸細胞，計數，然后到PHBHHx膜中進行培養，培養3天后，將細胞固定后，加入DAPI染色劑進行細胞染色，觀察細胞的形態，結果如圖2所示，mESC與PHBHHx膜粘附良好，細胞生長迅速，形態正常。并通過CCK-8試劑盒測定細胞的活力，觀察細胞在膜上的增值情況。如圖3所示。

3.掃描電鏡觀察mESC在PHBHHx膜上的生長粘附狀態 在mESC接種到PHBHHx膜上培養3天后，吸棄培養基，PBS洗3遍后，用0.25%戊二醛固定后，制成掃描電鏡標本后上機檢測，如圖4所示。細胞粘附在PHBHHx膜上，生長良好。

圖4 掃描電鏡圖片 A：PHBHHx膜形態(×1000)；B：mESC在PHBHHx膜上生長(×1000)

4.免疫熒光染色 在mESC接種到PHBHHx膜上誘導分化15d后，對其進行心肌細胞特異性標志蛋白-肌鈣蛋白(cTnT)進行免疫熒光染色，蛋白發出紅色熒光，位于細胞質中，細胞核標記為藍色，見圖5。

圖5 免疫瑩光染色圖 A：不加任何誘導劑組與PHBHHx膜共培養cTnT的表達；B：加維生素C誘導劑組與PHBHHx膜共培養cTnT的表達

5.流式細胞學測定cTnT的表達 在mESC與PHBHHx膜共培養誘導分化15d后，對其進行心肌細胞特異性標志物cTnT進行流式細胞學檢測，結果如圖6：加維生素C誘導劑組cTnT(47.5±1.5)%>未加任何誘導劑組(7.1±1)%(P<0.05)。對于mESCs向心肌細胞的分化，在添加維生素C誘導劑的情況下，PHBHHx膜細胞培養分化cTnT的表達量(60.3±1.8)%傳統的細胞培養皿培養(47.5±1.5)%(P<0.05)。

討 論

近年來，干細胞移植治療心肌梗死后心力衰竭是非常新穎的方法，大量的實驗證明其在心肌細胞治療領域的有效性[6]。胚胎干細胞因能夠分化為人體所有三胚層細胞，所以成為應用非常廣泛的種子細胞[7]。研究者發現通過將胚胎干細胞注入小鼠梗死模型中可以改善小鼠的左心室收縮功能[6]。但是，由于缺少相應的載體，所以在移植治療過程中會導致細胞大量的流失[8]，導致治療效果欠佳。所以尋找一種能夠模擬細胞外基質的補片材料來為移植細胞提供良好的生存環境是我們迫切需要解決的問題，能夠提高干細胞在移植區的存活并促進移植細胞向心肌細胞的分化。

聚羥基脂肪酸脂是組織工程學中常用的材料，近年來發展較為迅速[9]。作為醫用材料已經應用到臨床的各個方面。PHBHHx作為PHA家族中非常重要的一員，具有非常優良的生物相容性。先前的研究發現PHBHHx可以促進骨髓間充質干細胞向軟骨細胞分化[10]，并且可以和神經干細胞良好的融合并能夠促進神經干細胞向神經細胞分化[11]。本實驗在此基礎上，利用小鼠胚胎干細胞與PHBHHx材料制作的細胞補片共培養，研究PHBHHx材料在治療心肌梗死方面的潛力。我們發現，PHBHHx膜材料可以與mESC完美融合，mESC可以在PHBHHx膜上粘附生長，且相對于傳統的細胞培養皿培養，PHBHHx膜培養更能促進mESC的增殖，培養3天后，我們用CCK-8法測定細胞活力，PHBHHx膜組0D值為(0.726±0.021)，顯著高于傳統的細胞培養皿培養mESC的OD值(0.312±0.004)，如上圖3。之后我們加入誘導分化培養基發現，在不用添加任何誘導劑的情況下，mESCs向心肌細胞分化其肌鈣蛋白cTnT的表達量為(8.19±0.88)%，

圖6 流式細胞學測定cTnT表達 A:不加任何誘導劑也無PHBHHx膜組cTnT蛋白的表達(8.19%)；B：加維生素C誘導劑但無PHBHHx膜組蛋白cTnT的表達(49.41%)，圖示為誘導效率最高的一組；C：不加任何誘導劑與PHBHHx膜共培養心肌細胞特異性蛋白cTnT的表達(12.87%)；D：加誘導劑維生素C與PHBHHx膜共培養心肌細胞cTnT蛋白的表達(53.40%)，圖示為誘導效率最高的一組

本研究發現PHBHHx膜與mESC有較好的組織相容性，并且能夠促進mESC的增殖和分化,但是需要進一步的動物實驗研究補片材料能否改善心肌梗死后的心臟收縮功能。